液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC）及液-固色譜(LSC）。現(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點。
液相色譜儀操作步驟：
1. 首先對流動相進(jìn)行過濾，根據(jù)需要選擇不同的濾膜，一般為有機(jī)系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2. 對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。
3. 正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鐘，然后再進(jìn)入測試用流動相(如流動相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機(jī)相沖凈為止) 。
4. 一般情況下，流動相沖洗20-30分鐘后，儀器方可穩(wěn)定，比較重要的是儀器基線走后，方可進(jìn)樣測試。
5. 同時進(jìn)兩針標(biāo)樣，將其結(jié)果相比較，其結(jié)果的比值在0.98-1.02之間后，就可以正式進(jìn)行樣品的測試了。
6. 樣品測試結(jié)束后，就要進(jìn)行色譜儀及色譜柱的清洗和維護(hù)。如流動相為緩沖試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鐘，方可用有機(jī)相進(jìn)行保護(hù)，否則，有損色譜柱。
7). 關(guān)機(jī)時，先關(guān)計算機(jī)，再關(guān)液相色譜。
液相色譜注意事項：
1. 流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。
2. 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3. 所有過柱子的液體均需嚴(yán)格的過濾。
4. 壓力不能太大，建議不要超過150kgf/cm2 .
5. 因為緩沖試劑遇有機(jī)溶劑，會結(jié)晶，有損色譜柱，所以，每次由有機(jī)相變流動相或流動相變有機(jī)相均需用蒸餾水清洗。
液相色譜儀的應(yīng)用，可用于高沸點、熱穩(wěn)定性差以及具有生理活性物質(zhì)的分析。一般來說，沸點在450℃以下，相對分子質(zhì)量小于450的有機(jī)物可用液相色譜儀分析，但這些物質(zhì)只占有機(jī)物的15%～20%，其余的80%～85%有機(jī)物原則上都可采用高效液相色譜儀分析。
色譜柱的使用和維護(hù)，色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。調(diào)節(jié)流速太快，避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
反沖色譜柱，一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效，預(yù)柱和保護(hù)柱，選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。
有時可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)，由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。
工作原理，利用混合物各組分在固定相和流動相中溶解、分配或吸附等化學(xué)作用性能的差異，使各組分在作相對運(yùn)動的兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離。
從液相色譜儀工作流程中看到，色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。
色譜填料：經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。
色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長250mm。
色譜柱：也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的，色譜柱的填充，干法填充：在硬臺面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺面墩10-20次。
濕法填充：又稱淤漿填充法，使用專門的填充裝置。
液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜及液-固色譜?，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點。
1、 泵。
泵是液相色譜儀的心臟。處于良好工作狀態(tài)的泵，基線平穩(wěn)，保留時間重現(xiàn)性好，梯度洗脫時壓力變化緩慢而且平穩(wěn)。
1)選擇優(yōu)質(zhì)的溶劑和試劑，在進(jìn)入儀器前用 0.45um 膜過濾，并進(jìn)行脫氣處理。
2)泵開始使用時，一定要用合適的流動相徹底清洗干凈。
3)定期檢查并更換在線過濾片及有關(guān)的墊圈，經(jīng)常清洗進(jìn)液處的微孔濾頭。
4)改變流動相時，應(yīng)注意沉淀的產(chǎn)生，以防止泵堵塞。
2、色譜柱。
色譜柱是化合物分離的關(guān)鍵。保養(yǎng)良好的色譜柱具有很高的塔板數(shù)，基線平穩(wěn)。
1)色譜柱比較嬌氣不能夠碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震蕩;安裝時要保證閥件或管路的清潔。
2)流動相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，盡量不使用或少使用高粘度的流動相。
3)在滿足靈敏度的前提下，盡可能的使用小進(jìn)樣量。如果樣品比較臟，要進(jìn)行凈化或提純處理。
4)分析結(jié)束后要清洗掉進(jìn)樣閥中殘留的樣品，并用流動相或適當(dāng)?shù)娜軇┣逑瓷V柱。
5)如長期不用，用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑保存并封閉或定期補(bǔ)充合適的流動相。
3 、檢測器
分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。
4 、進(jìn)樣器
分析結(jié)束后反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染或堵塞。
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