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色譜柱的種類與評(píng)價(jià) 色譜柱操作規(guī)程

時(shí)間:2020-06-20    來(lái)源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導(dǎo)讀】一般地說(shuō),根據(jù)樣品的性質(zhì)決定采用何種液相色譜方法,然后再選擇不同類型的柱。即不同類型的柱則代表了不同的色譜方法。 不同種類色譜柱的差異在于柱結(jié)構(gòu)、柱填料和柱尺寸的不同。 色譜柱有不同的尺寸(長(zhǎng)

一般地說(shuō),根據(jù)樣品的性質(zhì)決定采用何種液相色譜方法,然后再選擇不同類型的柱。即不同類型的柱則代表了不同的色譜方法。

不同種類色譜柱的差異在于柱結(jié)構(gòu)、柱填料和柱尺寸的不同。

色譜柱有不同的尺寸(長(zhǎng)度和內(nèi)徑),分制備型、常規(guī)分析型和微型。不同類型柱的硬件也不同,(包括接頭、柱管等方面),還有徑向加壓柱和夾套加熱柱等。

不同液相色譜法的尺寸根據(jù)需要可以選取,普通分析3~30cm長(zhǎng),內(nèi)徑4~8mm。常用20cm長(zhǎng)、4.6mm內(nèi)徑的柱。制備型柱內(nèi)徑一般為8mm、25cm長(zhǎng)。微型柱內(nèi)徑l~3mm,長(zhǎng)10~20cm。不同的填料分析的效果可能不同,這是因?yàn)樯a(chǎn)過(guò)程不同所致。同一廠商生產(chǎn)的同種填料因批號(hào)不同也會(huì)有差異,這種差異可能從基質(zhì)就開(kāi)始(表面積、雜質(zhì)、特殊處理),還有鍵合的化學(xué)物質(zhì)(一氯或三氯硅烷反應(yīng)劑),不同廠家生產(chǎn)的填料還會(huì)因?qū)@夹g(shù)(預(yù)處理、鍵合過(guò)程、填裝技術(shù))等不同而呈現(xiàn)較大差異。由于種種差異、僅能假設(shè)同一批號(hào)的柱有基本相同的性質(zhì)。

多數(shù)柱填料基質(zhì)采用多孔硅膠微粒,通常有球形和無(wú)定形兩種,具有不同的粒度、孔徑和表面積。多孔聚合物微粒也適用于反相色譜。聚合物柱的流動(dòng)相范圍廣,流動(dòng)相pH值可在1至13之間。而硅膠基質(zhì)pH僅能在2.5和7之間。顯然,聚合物柱要好一些,但目前仍是以硅膠基質(zhì)的柱為主。原則上,聚合物柱可以克服硅膠基質(zhì)柱的某些不足,但需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí),要進(jìn)一步考查聚合物基質(zhì)填料的全面優(yōu)越性。

在實(shí)際工作中,選擇性能良好的色譜柱可得到好的結(jié)果,首先要注意柱徑、長(zhǎng)度、填料種類和填料粒度。

評(píng)價(jià)色譜柱的好壞不僅只是N數(shù),還應(yīng)考慮組分在柱上的保留、鍵合相表面的物性、柱壓降以及峰不對(duì)稱因子As等。每一根新色譜柱都應(yīng)標(biāo)出詳細(xì)參數(shù),主要內(nèi)容包括公司名稱、柱名稱(商標(biāo))、柱填料、尺寸。附一張標(biāo)準(zhǔn)參考色譜圖,并標(biāo)出色譜條件、樣品名稱、流動(dòng)相組成、流速、柱溫、進(jìn)樣體積、檢測(cè)器、峰的保留時(shí)間及峰名稱等。評(píng)價(jià)一根色譜柱的主要指標(biāo)是:①塔板數(shù)N值;②峰不對(duì)稱因子As;③柱壓降;④鍵合相濃度。

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色譜柱的正確使用和維護(hù)

  色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中,需要注意下列問(wèn)題,以維護(hù)色譜柱。

  1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩(如前所述)。

  2.選擇使用適宜的流動(dòng)相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

  3.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?/p>

  4.一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。

  5.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

  6.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡,每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50~75ml。

  7.色譜柱使用過(guò)程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。

  8.保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。

標(biāo)簽: 色譜柱
色譜柱 色譜柱的正確使用和維護(hù)_色譜柱
  今天有人問(wèn),《色譜柱使用記錄》表里樣品進(jìn)樣針數(shù)后面為什么還有個(gè)累計(jì)進(jìn)樣針數(shù)?
 
  套用哲學(xué)觀點(diǎn),任何物質(zhì)都是有壽命的,大到宇宙,小到原子,但是不同的物質(zhì)壽命是不一樣的。
 
  每一根色譜柱都有一個(gè)大致的進(jìn)樣針數(shù)壽命,理論上可以有一個(gè)規(guī)定,達(dá)到進(jìn)樣多少針,就強(qiáng)制報(bào)廢。不過(guò)好像并沒(méi)有這樣的規(guī)定,那么也可以作為一個(gè)參考,當(dāng)色譜柱的柱性能參數(shù)(就是常說(shuō)的理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等等)不達(dá)標(biāo)時(shí),參照進(jìn)樣針數(shù)判斷是柱子壽命到了,屬于不可逆因素,只能換柱子。還是其它原因,如流動(dòng)相配制錯(cuò)誤,或者流動(dòng)相變質(zhì)了,也可能稀釋液強(qiáng)度太大,也可能是方法就是錯(cuò)的,也可能是樣品本身問(wèn)題。
 
  不過(guò)色譜柱的累積性損壞自然不是一朝一夕的事,柱性能是緩慢下降的,但是沒(méi)有一個(gè)特定的標(biāo)準(zhǔn),要看具體的分析方法,而且跟柱型號(hào)也有關(guān)系。常規(guī)的分析方法下C18柱壽命是很長(zhǎng)的,因?yàn)镃18柱是目前技術(shù)zui先進(jìn),質(zhì)量可靠,使用zui廣泛的色譜柱,在常規(guī)分析方法下,基本上不會(huì)損壞。但是如果流動(dòng)相比較特殊,如高鹽、高pH>8、低pH<1、高柱溫、高比例水相、高比例有機(jī)相等等,色譜柱的損壞就會(huì)相應(yīng)地加劇。
 
  這些可以算作是化學(xué)損傷,如果是操作不當(dāng),例如,流動(dòng)相和樣品溶液沒(méi)有過(guò)濾,或者撞擊色譜柱等,也會(huì)造成物理?yè)p傷,也會(huì)嚴(yán)重影響色譜柱壽命,甚至是“一招斃命”。
 
  前面提到了柱型號(hào),不同型號(hào)的色譜柱壽命當(dāng)然也不一樣,跟前面說(shuō)到的C18類似的,CN柱、苯基柱等鍵合硅膠柱都具有較長(zhǎng)的使用壽命。不過(guò)所有基于硅膠基質(zhì)的色譜柱都有一個(gè)天生的弱點(diǎn),就是硅膠是能被水溶解的,雖然溶解度很小,但是長(zhǎng)年累月使用,尤其在反相色譜系統(tǒng)中,累加了高鹽、高pH、高柱溫、高比例水相等方法參數(shù)后,硅膠的流失尤為明顯。我做過(guò)一個(gè)項(xiàng)目,流動(dòng)相含鹽,柱溫高達(dá)50度,基本上一根色譜柱半年就報(bào)廢了。不過(guò),是有一種方法可以解決這個(gè)問(wèn)題的,就是在色譜柱前加一個(gè)柱芯與色譜柱類型相同的預(yù)柱,也叫保護(hù)柱,當(dāng)流動(dòng)相里溶解預(yù)柱里的硅膠飽和以后,就不再侵蝕色譜柱的硅膠,從而大大延長(zhǎng)色譜柱壽命。不過(guò)不到萬(wàn)不得已還是不要使用特別苛刻的流動(dòng)相,要知道預(yù)柱的柱芯也是很貴的,那就是一根較短的色譜柱啊,就算保住了色譜柱,經(jīng)常換柱芯也是吃不消的。
 
  但是有一些類型的色譜柱,天生就是短命鬼,例如NH2柱,有時(shí)候好不容易平衡好系統(tǒng),進(jìn)個(gè)幾十針樣就OVER了,像是一次性的。就像焰火,它華麗的現(xiàn)身,轉(zhuǎn)瞬就湮滅了。這些就留待色譜柱專家們?nèi)ラ_(kāi)發(fā)更加穩(wěn)定可靠的新填料了。
 
  還有一類柱子,就是手性分離柱,這在醫(yī)藥行業(yè)是很大的一個(gè)應(yīng)用。通常手性色譜柱是正相柱,這就要求我們?cè)谑褂檬中灾耙劝严到y(tǒng)置換干凈,再接上柱子用流動(dòng)相沖洗平衡進(jìn)樣。通常是甲醇、異丙醇、正已烷+異丙醇、流動(dòng)相這樣的順序,如果忘記這個(gè)過(guò)程,會(huì)造成很大的麻煩。而且有一些手性柱是涂敷柱,例如淀粉、纖維素等大分子涂敷柱非常怕水,如果系統(tǒng)中原來(lái)的反相流動(dòng)相沒(méi)有置換干凈,就會(huì)對(duì)色譜柱造成不可逆損傷,甚至報(bào)廢。近年來(lái),科學(xué)家也開(kāi)發(fā)出了鍵合的手性柱,相比較要穩(wěn)定的多,甚至也可以應(yīng)用反相色譜系統(tǒng)。
 
  使用后對(duì)色譜柱的沖洗保存也比較重要,使用了緩沖系統(tǒng)的尤其要注意。這里推薦一個(gè)反相色譜系統(tǒng)的通用沖洗流程:將所有通道置換成含有較低有機(jī)相比例的水相中,比如10-30%乙腈或甲醇,然后沖洗1個(gè)小時(shí),然后再梯度增加有機(jī)相比例,各沖洗一定時(shí)間,終保留在高有機(jī)相比例的沖洗液里。低有機(jī)相比例的沖洗液是為了盡可能地沖洗緩沖鹽。通常低壓梯度洗脫的液相色譜儀采用的是四元泵,就是單泵四通道,比例閥混合。這種混合方式有個(gè)弊端,就是混合效果差,因?yàn)楦魍ǖ啦煌壤峭ㄟ^(guò)開(kāi)關(guān)各通道閥的時(shí)間來(lái)控制的。打比方乙腈:緩沖鹽=50:50,如果流速是1.0mL/min,并不是說(shuō)乙腈和緩沖鹽以各0.5mL/min的流速來(lái)混合;而是流速一直是1.0mL/min,但是在往復(fù)泵一個(gè)來(lái)回的時(shí)間內(nèi),兩個(gè)通道分別打開(kāi)一半的時(shí)間,也就是說(shuō)系統(tǒng)管道里是一段乙腈、一段緩沖鹽。這樣就會(huì)造成鹽的析出。所以,往往是兩通道混合,就算沒(méi)有用緩沖鹽,還是建議先按比例混合好了,然后走單通道,否則的話一樣會(huì)造成鹽析出,或者基線波動(dòng)。走梯度洗脫的話,往往會(huì)把有機(jī)相通道(B)中加入一定比例的水,或者把水相通道(A)配成梯度洗脫的初始比例,把有機(jī)相通道(B)配成梯度洗脫終的比例。
 
  這里有兩點(diǎn)需要說(shuō)明,一,一般認(rèn)為,色譜系統(tǒng)包括色譜柱的沖洗甚至保存,都可以使用流動(dòng)相,只是不加緩沖鹽、酸堿等。例如上面提到的乙腈:緩沖鹽=50:50,做完樣品以后,就可以用50%乙腈/水來(lái)沖洗保存。有一些品牌色譜柱,例如資生堂,建議如果不是含鹽或者強(qiáng)酸強(qiáng)堿,一般不建議沖洗。不過(guò)這只適合短期保存,也就是沒(méi)隔多久又要再次使用。長(zhǎng)期不用的色譜系統(tǒng)包括色譜柱還是應(yīng)該沖洗后保存在高比例低極性溶劑體系中。一般建議正相系統(tǒng)保存在正已烷:異丙醇=90:10,反相系統(tǒng)保存在乙腈:水=90:10或者100%乙腈中。第二,隨著快速分離色譜柱的發(fā)展,很多的低粒徑色譜柱得到應(yīng)用,而且往往柱溫也較高,通常達(dá)到50度或以上,這種色譜系統(tǒng)通常柱壓也較高,貿(mào)然用高比例水相沖洗可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)超壓??梢韵扔昧鲃?dòng)相沖洗,或者斷開(kāi)色譜柱,用高比例水相沖洗系統(tǒng),再接上柱子逐步提高有機(jī)相比例沖洗,也可以先調(diào)低流速?zèng)_洗。而且,待沖洗快要結(jié)束時(shí)再降低柱溫。
 
  下面說(shuō)說(shuō)氣相色譜柱,現(xiàn)如今填充柱幾乎退出了歷史,人們說(shuō)起氣相色譜柱自然就是石英毛細(xì)管柱。
 
  相比較液相色譜柱,感覺(jué)氣相柱要簡(jiǎn)單的多,而且,往往氣相柱各型號(hào)之間的專屬也不那么強(qiáng),往往一個(gè)樣品用多種色譜柱分析,通過(guò)調(diào)整溫度程序,也可以得到相類似的分析結(jié)果。結(jié)合到本文標(biāo)題,氣相色譜柱的進(jìn)樣針數(shù)同樣也僅供參考,不能作為色譜柱壽命的唯①參數(shù),影響氣相色譜柱的壽命的因素基本為高溫、高溫時(shí)間、樣品中的高沸物(包括一些在不適合的方法中,樣品的分解或聚合物)、載氣純度等。
 
  常規(guī)的氣相色譜柱通常是石英管表面涂敷的液體填料,所以一般情況下,氣相色譜的分離其實(shí)是氣化后的樣品在液體填料里的溶解再揮發(fā)的性質(zhì)不同來(lái)實(shí)現(xiàn)的。那么既然填料是液體,自然就會(huì)揮發(fā)了,氣相色譜柱的壽命zui大的影響因素就在這里。氣相色譜柱都會(huì)有一個(gè)極限溫度,一般使用溫度會(huì)在這個(gè)極限溫度下的20度左右。通常氣相分析方法是程序升溫的,高溫的溫度和保留時(shí)間決定了每一次進(jìn)樣對(duì)色譜柱的影響。不過(guò)不同類型的色譜柱因?yàn)槠涮盍系男再|(zhì)不同,其極限溫度也不同,自然zui高使用溫度就不同。反過(guò)來(lái)說(shuō),在相同使用溫度下,其壽命也不相同。
 
  不管什么分析方法都要盡可能的真實(shí)反應(yīng)樣品里的溶劑及所有物質(zhì)的含量, 氣相色譜分析樣品的首要條件是,樣品要能被氣化,就是進(jìn)樣口溫度及程序終溫要大于樣品的沸點(diǎn)(這也不是jue對(duì)的),當(dāng)樣品中有高沸點(diǎn)的物質(zhì),甚至是無(wú)機(jī)鹽、機(jī)械雜質(zhì),不能被氣化留在了襯管里,甚至留在了色譜柱中,就會(huì)對(duì)色譜柱有損傷。這種情況是要處理一下樣品,萃取、蒸餾、過(guò)濾都是常用的方法。如果實(shí)在無(wú)法避免,就要經(jīng)常更換隔墊、襯管玻璃毛等,過(guò)一定時(shí)間還要把色譜柱前段割一段下來(lái),通常是1米左右。除了這些,還應(yīng)注意對(duì)樣品性質(zhì)的了解,如果樣品的熱穩(wěn)定性差,進(jìn)樣分析過(guò)程中發(fā)生了分解或者聚合,產(chǎn)生高沸物就會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生很大影響,如果這些物質(zhì)不能被溶劑沖洗的話,這種損傷就是不可逆的,而且分析結(jié)果也不準(zhǔn)確。這種情況下就要適當(dāng)?shù)慕档蜏囟?,直到不發(fā)生這種反應(yīng)?;蛘邠Q其它的分析方法。
 
  通常我們使用的 載氣是高純氮?dú)?,原因就兩個(gè)字——便宜!但是,排除經(jīng)濟(jì)因素,這并不是一個(gè)zui佳的選擇。因?yàn)榈獨(dú)獾纳a(chǎn)就是液態(tài)空氣蒸發(fā)來(lái)的,但是因?yàn)榈獨(dú)夂脱鯕庑再|(zhì)接近,一般很難杜絕高純氮?dú)饫锖猩倭康难鯕狻Q鯕庠诟邷刂鶎?duì)整個(gè)氣相色譜系統(tǒng)包括色譜柱都會(huì)產(chǎn)生不良影響。所以一般儀器廠家還是建議使用高純氦,尤其在進(jìn)行計(jì)量、驗(yàn)證等高標(biāo)準(zhǔn)分析時(shí),不過(guò)一瓶高純氦可以換5瓶高純氮,一般用戶還是選擇使用高純氮?dú)?。其?shí)從儀器性能來(lái)講,也可以使用高純氫氣作為載氣,低含氧量、低背景、低廉的價(jià)格都是不錯(cuò)的選擇,當(dāng)然一般考慮到氫氣的泄漏以及儲(chǔ)運(yùn)的風(fēng)險(xiǎn),往往被用戶所排除。不過(guò),帶TCD檢測(cè)器的氣相色譜往往還是使用高純氫氣作為載氣。
 
  說(shuō)了這么多,zui后感性的總結(jié)一下。真正做儀器分析人,都能發(fā)現(xiàn)不同品牌的儀器,甚至每一臺(tái)儀器的不同,只有你真正熱愛(ài)儀器分析,把每一臺(tái)儀器當(dāng)成好
 
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