高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μM。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用較為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的PH值。但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的PH值會(huì)使硅膠溶解，太低的PH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在PH 1.5~10范圍操作。
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自動(dòng)進(jìn)樣器的故障容易被發(fā)現(xiàn)，有時(shí)液相色譜儀系統(tǒng)出了故障而不能確定是否是進(jìn)樣器故障，可以用手動(dòng)進(jìn)樣幾次，或用一臺(tái)好的自動(dòng)進(jìn)樣器代替，如排除了故障，說明自動(dòng)進(jìn)樣器有了問題。不同廠商的自動(dòng)進(jìn)樣器差異很大，除一些共性故障外，較好查閱操作手冊或與供應(yīng)商聯(lián)系。
除自動(dòng)進(jìn)樣器機(jī)械、控制系統(tǒng)可能出現(xiàn)故障外，在操作及方法學(xué)方面也可能出現(xiàn)相應(yīng)的問題，這里主要根據(jù)自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)特點(diǎn)，對試驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的問題進(jìn)行說明。
一、滯后體積
高效液相色譜儀中滯后體積是指流動(dòng)相混合器到柱頭的體積，包括溶劑混合器和混合器到柱頭之間連接管的體積，對于低壓混合系統(tǒng)，也包括泵體積。滯后體積較大可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差、方法移植困難。通常的HPLC系統(tǒng)中，滯后體積一般在0.2mL～5mL之間，主要取決于裝置的設(shè)計(jì)。
滯后體積中較重要的部分為自動(dòng)進(jìn)樣器的定量環(huán)體積。只有定量環(huán)體積小于100μL時(shí)，其對滯后體積的影響才可以近似不計(jì)。當(dāng)定量環(huán)體積較大時(shí)，這種影響將表現(xiàn)出來。例如，采用50μL的定量環(huán)時(shí)滯后體積為300μL，如果改用1mL定量環(huán)，滯后體積將變成1250μL，這種變化直接影響到色譜分離結(jié)果。在實(shí)際分離過程中，采用的色譜柱較細(xì)時(shí)，必須考慮滯后體積的影響，解決的辦法為更換較小的定量環(huán)，減小滯后體積。
二、樣品瓶過滿
如果樣品瓶過滿，在瓶蓋較緊、進(jìn)樣量較大的情況下，可能會(huì)導(dǎo)致進(jìn)樣重復(fù)性變差。其原因?yàn)闃悠菲恐械臉悠繁怀槌鰰r(shí)，蓋緊的瓶蓋不能使空氣及時(shí)進(jìn)入，造成部分真空。由于這種真空作用，注射器不能夠吸取足夠量的樣品體積。在極端的情況下，對于揮發(fā)性稀溶液樣品，針內(nèi)甚至?xí)霈F(xiàn)氣泡，影響分析工作的正常進(jìn)行。
有些自動(dòng)進(jìn)樣器采用加排空針的方法克服這一問題，但這種方法并不常用。較簡單的解決辦法為不要使樣品瓶過滿。一般裝樣量在樣品瓶的1／2到3／4之間較為適宜。
三、進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)
樣品量足夠多時(shí)，不必考慮這一問題。但對于痕量分析而言，進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)問題將較為突出。理想的情況下可以使進(jìn)針深入到接近樣品瓶底部，這樣可以較大限度地利用樣品。當(dāng)可用的樣品體積有限時(shí)，可以采用微量樣品瓶以增加給定體積樣品的相對深度。如果進(jìn)針過深，可能插入樣品瓶的底部，甚至導(dǎo)致針尖阻塞。如果進(jìn)針深度不足，樣品只及針尖部分，針將不能抽取足夠量的樣品，部分空氣取而代之。
對于進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)，一般采用機(jī)械或電動(dòng)的方法，目前大部分廠商可以在液相色譜儀色譜工作站上設(shè)置。無論采用哪種方法，實(shí)驗(yàn)之前都必須認(rèn)真調(diào)節(jié)，更換樣品瓶類型時(shí)還需要重新調(diào)整。
液相色譜柱是液相色譜儀的核心部件，且極易因使用不當(dāng)而損壞，不互溶的流動(dòng)相，不正確的保存方式及清洗都會(huì)降低色譜柱的使用壽命。因此液相色譜柱的日常維護(hù)保養(yǎng)極為重要。
1.流動(dòng)方向已明確標(biāo)明在色譜柱上，請正確安裝色譜柱，除非您想沖洗色譜柱入口的污染物，否則，請不要反接色譜柱。
2.反相柱做完實(shí)驗(yàn)后，若使用流動(dòng)相中含有緩沖溶液鹽，請?jiān)谑褂猛戤吅笥貌缓彌_劑的80%水-有機(jī)溶劑流動(dòng)相沖洗色譜柱，后換成100%有機(jī)溶劑貯存。
3.正相色譜柱正相使用保存在純正己烷中，反相使用時(shí)需要將柱內(nèi)貯存液用異丙醇置換。
4.流動(dòng)相與樣品在使用前可以用0.45um的微孔濾膜或用預(yù)處理柱（SPE固相萃取小柱）進(jìn)行預(yù)處理，并嚴(yán)格脫氣。
5.流動(dòng)相pH需保持在2-8之間，請盡量不超過適用范圍。
6.柱溫不要大于60℃。
7.壓力最高不超過30Mpa，建議在20Mpa以內(nèi)使用。
8.使用新鮮溶劑，防止細(xì)菌增長。
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