色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。關(guān)于色譜柱的安裝、維護(hù)、保存以及由色譜柱導(dǎo)致的這樣那樣的色譜故障也是一門學(xué)問。高效液相色譜柱的正確使用包含：加裝保護(hù)柱，過濾流動(dòng)相和樣品，凈化樣品，避免過高的柱壓，注意溫度和酸堿度，正確及時(shí)的沖洗等。
1.加裝保護(hù)柱
保護(hù)柱的作用是過濾掉來自流動(dòng)相和樣品的化學(xué)“拉圾”同時(shí)也可以有效除去流動(dòng)相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動(dòng)相吸入口、進(jìn)樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學(xué)污染,因此,加裝保護(hù)柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復(fù)雜混合物和生物樣品時(shí)更是保護(hù)分析柱必不可少的措施。
保護(hù)柱填料應(yīng)與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護(hù)柱屬消耗品,經(jīng)過一定次數(shù)的樣品分析(5～1次)后,出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時(shí),應(yīng)考慮更換保護(hù)柱。
2.過濾流動(dòng)相和樣品
流動(dòng)相通常由水或緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過色譜柱的流動(dòng)相均應(yīng)過濾,但在實(shí)際操作上應(yīng)視具體情況而有所區(qū)別:當(dāng)有機(jī)溶劑用色譜純級(jí),水用石英亞沸水或其它超純水時(shí),在能確保水和有機(jī)溶劑的質(zhì)量且沒有受到污染時(shí),過濾并無更多實(shí)際意義。
當(dāng)流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí),則過濾是必要的,如前所述,當(dāng)緩沖溶液放置一段時(shí)間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應(yīng)重新過濾。
所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng).45μm(.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。
裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。
3.凈化樣品
當(dāng)樣品中含有對(duì)色譜柱有損害的化學(xué)成分,如產(chǎn)生永久性吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機(jī)分子和強(qiáng)吸附性物質(zhì),以及可能對(duì)柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團(tuán)離子。在進(jìn)樣前應(yīng)盡可能對(duì)樣品進(jìn)行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分。
4.避免過高柱壓
雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達(dá)6psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會(huì)縮短色譜柱的壽命,避免的方法是
(1)柱壓過高時(shí),盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。
(2)當(dāng)流速較大時(shí),應(yīng)采取流速梯度的辦法使流速分步到位。
(3)使用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí),進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快。否則超過2%的壓力沖擊會(huì)很快使柱報(bào)廢。當(dāng)使用多柱聯(lián)用時(shí),柱切換要避免在高壓下進(jìn)行。
5.注意溫度和酸堿度
一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過6℃,以低于4℃為宜,特別是在流動(dòng)相pH接近使用限度時(shí),更應(yīng)降低使用溫度。
溫度過高會(huì)加快鍵合相的水解和硅膠的溶解,從而使填料性質(zhì)改變,柱床塌陷,降低柱效,改變峰形。
目前的鍵合硅膠色譜柱標(biāo)示的pH適用范圍可達(dá)2～1,但在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)避免極端的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在極端的pH條件下使用時(shí),可通過以下方法避免柱損害:
(1)在泵和進(jìn)樣閥之間加裝預(yù)柱(飽和柱)來飽和流動(dòng)相
(2)降低使用溫度
(3)檢驗(yàn)完畢后立即用與所使用的流動(dòng)相互相混溶的“溫和溶劑”徹底清洗。
6.正確及時(shí)的沖洗
開始試驗(yàn)前,應(yīng)了解柱中當(dāng)前是何種溶劑。對(duì)于新色譜柱,如無特殊說明均為評(píng)價(jià)報(bào)告中所用流動(dòng)相。柱中當(dāng)前溶劑一定要與分析樣品所用流動(dòng)相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。
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進(jìn)樣閥在進(jìn)樣過程中，必須是非常清潔的，否則得不到較好的結(jié)果。
進(jìn)樣閥切換到進(jìn)樣位置后（Inject），要在此位置上保持一段時(shí)間，使流動(dòng)相充分沖洗樣品定量管，這樣可以保證有較高的精確度，而且不用另外再?zèng)_洗樣品定量管。這種有色譜儀器控制的沖洗顯然要比手動(dòng)沖洗的更好些。
注意：沖洗需要的流動(dòng)相體積至少為所進(jìn)樣品的10倍。例如，如果取20ul樣品至100ul的定量管中，而流動(dòng)相此時(shí)的流速為1ml/min，則需要在進(jìn)樣位置上至少保持12s，即：20ul×10/1000ul·min-1＝0.2min＝112s。
當(dāng)樣品定量管經(jīng)過充分的沖洗后，可以將旋柄轉(zhuǎn)回取樣位置(Load)，也可以繼續(xù)保持在進(jìn)樣位置，到下次取樣前才切換回取樣位置。在切換回取樣位置時(shí)，將樣品進(jìn)樣針或微量樣品進(jìn)樣針從進(jìn)樣閥中拔出。
為防止交叉污染，正常情況下不必每次進(jìn)樣后都清洗進(jìn)樣閥注射針導(dǎo)入口。進(jìn)樣閥內(nèi)根據(jù)專利設(shè)計(jì)的直接連接進(jìn)樣孔，可以使注射針頭的前端直接連接到樣品定量管的末端，沒有其他空間供樣品殘留。這樣在下一次進(jìn)樣時(shí)，就不會(huì)有上一次殘留的樣品進(jìn)入定量管。
但是進(jìn)樣針頭插入或撥出過程中，會(huì)有痕量的樣品沉積在針頭密封區(qū)域。精密的測(cè)定顯示這種殘留有1nl-10nl。這表明進(jìn)20ul樣品，會(huì)殘留0.005%～0.05%。每次進(jìn)樣后沖洗注射針導(dǎo)入口可以將此殘留沖洗干凈。
沖洗注射針導(dǎo)入口的過程為：設(shè)定流動(dòng)相流速為0.1ml/min～1ml/min，將注射針導(dǎo)入口沖洗頭連接到一只體積較大的注射器上，用大量的流動(dòng)相只在進(jìn)樣位置清洗注射針導(dǎo)入口。這樣進(jìn)入進(jìn)樣閥中的液體繞過樣品定量管由樣品溢出管口排出。這一過程可以將注射針導(dǎo)入口、引導(dǎo)管、注射針導(dǎo)入管和注射針密封圈徹底清洗。而采用注射器完全插入式的沖洗方式，則不能全部清洗上述部件的表面。在取樣位置將注射針插入注射針導(dǎo)入口時(shí)，針頭推動(dòng)注射針密封圈內(nèi)少量樣品液體（上一次沖洗注射針導(dǎo)入管留下的）進(jìn)入樣品定量管。當(dāng)該樣品液體與所用的流動(dòng)相組成不同，且同時(shí)采用部分充滿定量管的進(jìn)樣方式時(shí)，在高靈敏度的檢測(cè)器上可能出現(xiàn)怪峰。
所以沖洗注射針時(shí)可以用流動(dòng)相沖洗。
如果已發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的交叉污染現(xiàn)象，請(qǐng)檢查是否有下列原因造成：
1.使用的注射針頭長(zhǎng)度不夠（針頭的長(zhǎng)度至少5cm），注射針末端不能到達(dá)定子表面。
2.注射針沒有充分插入注射針導(dǎo)入口。
3.注射針導(dǎo)入口的污染物或針頭密封磨損下來的削片，使注射針末端不能接觸定子表面。
如果不考慮交叉污染，每進(jìn)樣10次，或20次可以沖洗一下注射針導(dǎo)入口，這樣可以保證注射針導(dǎo)入管內(nèi)充滿流體。在注射針插入或拔出的過程中，清洗注射針頭或稀釋污染這一區(qū)域的樣品的同時(shí)也使注射針導(dǎo)入口和樣品溢出口充滿流體，從而防止空氣進(jìn)入樣品管。
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液相色譜柱在使用前，可以進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要留意： 液相色譜柱柱性能可能由于所使用的樣品、活動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是較佳條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。 1、樣品的前處理： a、可以使用活動(dòng)相溶解樣品。 b、使用予處理柱除往樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。 c、使用0.45μm的過濾膜過濾除往微粒雜質(zhì)。 2、活動(dòng)相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與活動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求活動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： a、活動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保存在柱中）。 b、活動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。 c、活動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命（可運(yùn)用進(jìn)步溫度的方法降低活動(dòng)相的黏度）。 d、活動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，可以使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。 e、活動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則輕易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。 f、在活動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除往溶解在活動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止活動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。 3、活動(dòng)相流速的選擇： 因柱效是柱中活動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，可以使用較佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。如何讓液相色譜柱的測(cè)試結(jié)果更有可比性
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