色譜柱用久后常出現柱壓升高,柱效降低,峰形畸變,保留時間改變等變化,如不采取適當措施,色譜柱將無法再使用,縮短色譜柱的使用壽命。在高效液相色譜儀的使用中,保持高效液相色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長柱子的使用壽命非常重要。
1、流動相對色譜柱的損害因素
顆粒雜質:目前廣泛使用的柱填料直徑多在10um以下,微小的顆粒雜質很容易使柱子發(fā)生堵塞,因此使用的溶劑應當過濾,柱子上端接頭應當裝微孔過濾片以阻擋顆粒物進入柱中。
水溶液中的微生物:以水溶液為流動相時,應防止細菌的生長,五氯酚、疊氮化鈉、辛酸等能防止細菌生長。當用水溶液或有機酸緩沖液保護柱子時,一些厭氧霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。
pH值:對硅膠基鍵合相填料,水溶液pH值不可超過2-7.5這一范圍,當pH>8時,硅膠會釋出
生成絮狀物堵塞柱子,且難以復原,柱效很快降低,甚至完全失效。
鹽類析出:當在流動相緩沖液中加入和水混溶的有機溶劑時,其中的鹽類溶解度下降,可析出鹽類沉淀,堵塞柱子;加入粘度不同的樣品溶液也可能發(fā)生類似現象。所以緩沖液中鹽的濃度宜低,樣品提取液的組成應和流動相匹配。
2、樣品對色譜柱的損害因素
雜質堵塞:樣品中的微粒同樣會使柱子堵塞,樣品也應進行過濾處理。
樣品組分的不可逆吸附:通常被吸附的組分有蛋白質、醣等,可以采取加裝保護柱,或使用適應的溶劑反沖來處理。常用溶劑有四氫呋喃(適用于溶解有機高聚物和工業(yè)樣品中的焦油)、高濃度的脲或鹽酸胍溶液(使蛋白質改性而洗脫)、高離子強度的磷酸鹽緩沖液(pH=7,適合反相柱和離子交換柱,可除去蛋白質和醣等)。
樣品組分與固定相反應:這種反應對NH2柱的影響較嚴重,NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少活性點,使保留時間縮短,因此羰基化合物樣品和流動相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。
活性點被覆蓋:由于固定相吸附樣品中的組成或雜質而使活性點被覆蓋,在柱壓升高的同時保留時間減少,將樣品過濾或使用萃取分離柱(對大分子有機物如蛋白質、白細胞等)效果較好。
3、色譜柱固定相的化學變化
色譜柱固定相分解、活性基團變性以及鍵合相基團脫落會使保留時間顯著變化。
1、鍵合相基團脫落
絕大多數鍵合相都是通過硅氧硅鍵(Si-O-Si)連接在硅基質上,形成帶有機基團的固定相Si-O-Si-R(R為、G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅鍵可在水溶液中水解而斷裂,使鍵合相基團脫落,對C2和NH2柱鍵合相基團脫落不可忽視。為減少或防止基團脫落,可增加流動相的有機溶劑量,降低離子強度和pH值,對基團已脫落的固定相,可用合適的硅烷試劑再生。
2、固定相分解或活性基團變性
例如氰基柱的保留時間顯著縮短,但鍵合相中C、H、N的百分含量并無大變化,證明未發(fā)生—CN水解成-COOH反應,而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可減少水解。
4、高效液相色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱在使用一段時間后,常遇到柱子受污染,柱效下降的問題,采用適當的方法對色譜加以保護和再生,能夠延長色譜柱的使用壽命。
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1.進樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作,進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4X107Pa,流速可調且穩(wěn)定,當高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內徑為2~5mm,由"優(yōu)質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,住內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成).固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000?)和比表面積大的特點,加之其表面經過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此,這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外,固定相基質粒小,柱床極易達到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴散效應?;|粒度小,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析,基質粒度小,塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小,會提高分辨率的道理。再者,高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C,通過改善傳質速度,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率。
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