色譜柱可分為填充柱和開(kāi)管柱兩大類(lèi)。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤(pán)管形、U形管等形狀。

    液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。

    硅膠色譜柱使用方法

    稱(chēng)量。

    200-300目硅膠，稱(chēng)30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱(chēng)40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。

    2.攪成勻漿。

    加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢琛Ｈ绻疵搫┦鞘兔?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌。

    3.裝柱。

    將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚，裝上蓄液球，打開(kāi)柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會(huì)有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚將其沖入柱中。

    4.壓實(shí)。

    沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。

    無(wú)論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過(guò)柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開(kāi)裂。

    5.上樣。

    干法濕法都可以。海沙是沒(méi)必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。

    然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會(huì)沖壞硅膠表面。

    6.過(guò)柱和收集。

    柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。

    收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。

    7.檢測(cè)。要更多地使用專(zhuān)用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會(huì)損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。

    8.送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。

    如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過(guò)一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段。可除去氫譜1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。

    色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。

    1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。

    2.選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

    3.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>

    4.一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。

    5.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

    6.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。

    7.色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。

    8.保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。