高效液相色譜儀也叫高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜等,它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
由于液相色譜分析技術涉及的樣品種類繁多、樣品組成及其濃度復雜,樣品物理形態(tài)多變,對液相色譜儀的正常分析測定造成一些干擾因素,如果不注意儀器的維護和保養(yǎng),會對日常的分析測定帶采不便,所以需要對儀器的使用以及維護要做一些了解才能熟練掌握這種分析技術。
高效液相色譜儀的操作過程:
1、翻開HPLC工作站(包含計算機軟件和色譜儀),銜接好活動相管道,銜接檢測體系。
2、對抽濾后的活動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3、過濾活動相,根據(jù)需求挑選不一樣的濾膜。
4進入HPLC操控界面主菜單,點擊manual,進入手動菜單。
5、有一段時刻沒用,或許換了新的活動相,需求先沖刷泵和進樣閥。沖刷泵,直接在泵的出水口,用針頭抽取。沖刷進樣閥,需求在manual菜單下,先點擊purge,再點擊start,沖刷時速度不要超越10ml/min。
6、調理流量,初度運用新的活動相,能夠先試一下壓力,流速越大,壓力越大,通常不要超越2000。點擊injure,選用適宜的流速,點擊on,走基線,調查基線的狀況。
7、規(guī)劃走樣辦法。點擊file,選擇select?users?and?methods,能夠選擇現(xiàn)有的各種走樣辦法。若需樹立一個新的辦法,點擊new?method。選擇需求的配件,包含進樣閥,泵,檢測器等,根據(jù)需求而不一樣。選完后,點擊protocol。一個完整的走樣辦法需求包含:a、進樣前的穩(wěn)流,通常2-5分鐘;b、基線歸零;c、進樣閥的loading-inject變換;d、走樣時刻,隨不一樣的樣品而不一樣。
8、進樣和進樣后操作。選定走樣辦法,點擊start。進樣,一切的樣品均需過濾。辦法走完后,點擊postrun,可記載數(shù)據(jù)和做符號等。悉數(shù)樣品走完后,再用上面的辦法走一段基線,洗掉剩余物。
9、關機時,先關計算機,再關液相色譜儀。
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現(xiàn)代高效液相色譜中,分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬,要做合適的選擇,首先必須對此有一定的認識和了解。
液相色譜填料可以是陶瓷性質的無機物基質,也可以是有機聚合物基質。液相色譜填料中的有機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大,在溶劑中不容易膨脹。
液相色譜填料中有機聚合物基質主要有交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮,溶劑或溶質容易滲入有機基質中,導致填料顆粒膨脹,結果減少傳質,最終使柱效降低。
液相色譜填料的粒度選擇
液相色譜填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù),即柱效和背壓。粒度越小,填充柱的柱效越高;然而粒度越小,柱壓越大,柱壓的增加限制了粒度小于3μm的填料應用。在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度,但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小粒度的填料是很有用的。3μm填料填充柱的柱效比相同條件下的5μm填料的柱效提高近30%;然而,3μm的色譜柱的背壓卻是5μm的2倍。與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱,以縮短分析時間。另外,可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。
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