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高效液相色譜儀的操作過程 液相色譜常見問題解決方法

時間:2020-06-28    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導讀】高效液相色譜儀也叫高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜等,它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)



    高效液相色譜儀也叫高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜等,它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

    由于液相色譜分析技術涉及的樣品種類繁多、樣品組成及其濃度復雜,樣品物理形態(tài)多變,對液相色譜儀的正常分析測定造成一些干擾因素,如果不注意儀器的維護和保養(yǎng),會對日常的分析測定帶采不便,所以需要對儀器的使用以及維護要做一些了解才能熟練掌握這種分析技術。

    高效液相色譜儀的操作過程:

    1、翻開HPLC工作站(包含計算機軟件和色譜儀),銜接好活動相管道,銜接檢測體系。

    2、對抽濾后的活動相進行超聲脫氣10-20分鐘。

    3、過濾活動相,根據(jù)需求挑選不一樣的濾膜。

    4進入HPLC操控界面主菜單,點擊manual,進入手動菜單。

    5、有一段時刻沒用,或許換了新的活動相,需求先沖刷泵和進樣閥。沖刷泵,直接在泵的出水口,用針頭抽取。沖刷進樣閥,需求在manual菜單下,先點擊purge,再點擊start,沖刷時速度不要超越10ml/min。

    6、調理流量,初度運用新的活動相,能夠先試一下壓力,流速越大,壓力越大,通常不要超越2000。點擊injure,選用適宜的流速,點擊on,走基線,調查基線的狀況。

    7、規(guī)劃走樣辦法。點擊file,選擇select?users?and?methods,能夠選擇現(xiàn)有的各種走樣辦法。若需樹立一個新的辦法,點擊new?method。選擇需求的配件,包含進樣閥,泵,檢測器等,根據(jù)需求而不一樣。選完后,點擊protocol。一個完整的走樣辦法需求包含:a、進樣前的穩(wěn)流,通常2-5分鐘;b、基線歸零;c、進樣閥的loading-inject變換;d、走樣時刻,隨不一樣的樣品而不一樣。

    8、進樣和進樣后操作。選定走樣辦法,點擊start。進樣,一切的樣品均需過濾。辦法走完后,點擊postrun,可記載數(shù)據(jù)和做符號等。悉數(shù)樣品走完后,再用上面的辦法走一段基線,洗掉剩余物。

    9、關機時,先關計算機,再關液相色譜儀。





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  液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體,又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)?,F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較,具有快速、靈敏等特點。
 
  基本故障
 
  1、柱壓高原因
 
  (1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內;
 
  (2)樣品污染沉積。處理對于首種情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,zui后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。[1]
 
  2、氣泡溢出
 
  流動相內有氣泡,關閉泵,打開泄壓閥,打開purg鍵,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進入流動相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內,過濾器內部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時,輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內部的霉菌菌團已被硝酸破壞,流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調至1.0~3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。
 
  3、既無壓力指示,又無液體流過
 
  (1)泵密封墊圈磨損;
 
  (2)大量氣泡進入泵體。處理對于首種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時,用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
 
  4、壓力波動大,流量不穩(wěn)定
 
  原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
 
  5、出峰不佳,峰分叉
 
  (1)色譜柱被污染;
 
  (2)柱頭填料塌陷。處理對于首種情況,先用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,zui后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。
 
  6、峰面積重復性不佳
 
  (1)進樣閥漏液;
 
  (2)加樣針不到位。
 
  (3)液量不足.
【導讀】現(xiàn)代高效液相色譜中,分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬,要做合適的選擇,首先必須對此有一定的認識和了解。液相色譜填料



    現(xiàn)代高效液相色譜中,分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬,要做合適的選擇,首先必須對此有一定的認識和了解。

    液相色譜填料可以是陶瓷性質的無機物基質,也可以是有機聚合物基質。液相色譜填料中的有機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大,在溶劑中不容易膨脹。

    液相色譜填料中有機聚合物基質主要有交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮,溶劑或溶質容易滲入有機基質中,導致填料顆粒膨脹,結果減少傳質,最終使柱效降低。

    液相色譜填料的粒度選擇

    液相色譜填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù),即柱效和背壓。粒度越小,填充柱的柱效越高;然而粒度越小,柱壓越大,柱壓的增加限制了粒度小于3μm的填料應用。在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度,但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小粒度的填料是很有用的。3μm填料填充柱的柱效比相同條件下的5μm填料的柱效提高近30%;然而,3μm的色譜柱的背壓卻是5μm的2倍。與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱,以縮短分析時間。另外,可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。





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