熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。熒光分光光度計(jì)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡便、工作曲線線形范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和藥理學(xué)、有機(jī)和無機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域。
熒光分光光度計(jì)工作原理：
由光源氙弧燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機(jī)帶動的凸輪所控制，當(dāng)測繪熒光發(fā)射光譜時，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動，將各波長的熒光強(qiáng)度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜（emissionspectrum），簡稱熒光光譜。
熒光分光光度計(jì)測試注意事項(xiàng)：
①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。
?、谠跓晒夥治鰰r，為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長波長、低人射光強(qiáng)度及短時間光照。
?、蹨囟茸兓梢馃晒鈴?qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結(jié)果幾乎無影響。
?、墚?dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。
?、轃晒馕镔|(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、02、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴(yán)格的熒光實(shí)驗(yàn)中必須除02。
熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對這些參數(shù)的測定，不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化，從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長掃描范圍一般是190~650nm，發(fā)射波長掃描范圍是200~800nm。可用于液體、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。
熒光分光光度計(jì)的原理：
由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過濾過和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來。
物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在返回基態(tài)的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光。
不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同，其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來定性地進(jìn)行物質(zhì)的鑒定。
在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時，其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系，即IF=KC，利用這種關(guān)系可以進(jìn)行熒光物質(zhì)的定量分析，與紫外-可見分光光度法類似，熒光分析通常也采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行。
熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)屬一類產(chǎn)品，結(jié)構(gòu)均由激發(fā)光源、單色器、樣品室、光電倍 增管和讀出（記錄）裝置所組成。但是它們光源是不同的，熒光分光光度計(jì)多采用高壓汞燈、氙燈和激光光源。同時，熒光測量多采用激發(fā)光和發(fā)射光成直角的光路，儀器組件的布置有所不同。
下圖為某型號熒光分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)圖，其主要工作原理是：當(dāng)光源光束經(jīng)入射單色器色散，提取所需波長單色光照射于樣品上，由樣品發(fā)出的熒光經(jīng)發(fā) 射單色器色散后照射于光電倍增管，光電倍增管把熒光強(qiáng)度信號轉(zhuǎn)化成電信號并經(jīng)放器放大后記錄或讀出信號。
熒光分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)圖
1.氙燈（150W）；2.透鏡；3.光束分裂器；4.水平狹縫；5.激發(fā)單色器光柵；6.參考放電管；7.關(guān)閘；8.樣品室關(guān)閘；10.發(fā)射單色器光柵；12.光電倍增管
(1)激發(fā)光源：要比吸收法中光源強(qiáng)度大。
汞燈：發(fā)射強(qiáng)度大、穩(wěn)定，不需復(fù)雜電源，但譜線不連續(xù)，數(shù)目少，主要用于濾片熒光計(jì)。
碘鎢燈：提供連續(xù)光譜300~700mn。
氙燈：發(fā)出射線的強(qiáng)度大，譜線連續(xù)，分布于200~700 nm光域內(nèi)，且在300~400nm 波段內(nèi)射線強(qiáng)度幾乎相等，但該燈的電源功率要求大，且電源穩(wěn)定，因此電源結(jié)構(gòu)復(fù)雜。
激光：發(fā)光強(qiáng)度大，能極大地提高熒光分析的靈敏度。
(2)樣品池：通常由石英池（液體樣品用）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）組成。測量液體時，光源與檢測器成直角安排；測量固體時，光源與檢測器成銳角安排。低溫?zé)晒鉁y定時在一樣品池外套一個液氮的透明石英真空瓶。
(3)單色器：熒光分光計(jì)通常具有兩個濾光片：第一濾光片在光源與樣品池之間，濾去不需要的光，讓需要的激發(fā)光通過。第二濾光片在樣品池與檢測器之間，濾去溶劑散射 光、容器表面散射光、雜質(zhì)發(fā)出的光等，讓待測物質(zhì)發(fā)射的熒光通過。
熒光分光光度計(jì)通常具有兩個光柵，位置同濾光片，單色性好。
(4)檢測器：因熒光通常較弱，采用光電倍增管作檢測器，靈敏度高。選擇光電倍增管要考慮：響應(yīng)波長、靈敏度和嗓聲水平。 藍(lán)敏管對蛋白質(zhì)、核酸的測量適用，而紅敏管則適用于熒光染料檢測。
(5)顯示系統(tǒng)：光度表、計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)等。
補(bǔ)充說明：與紫外分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)區(qū)別：
1.熒光分光光度計(jì)采用的是垂直的測量方式，以消除透射光的影響。
2.檢測器前面有無單色器，熒光分光光度計(jì)有兩個單色器又上圖可以看出，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其他雜散光干擾。
正確了解熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)，也是能夠幫助我們更好使用和操作，一定要仔細(xì)閱讀哈~
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