熒光的原理是某些物質(zhì)會在高強度的短波長光線照射下，會發(fā)出波長稍長的發(fā)射光（熒光）。而我們一般都是觀察被激發(fā)熒光基團所發(fā)射出來的波長稍長的發(fā)射光（熒光）。

　　但是激發(fā)的光會很強，所以我們就需要把激發(fā)的光全部濾去，這樣才可以看到熒光基團的發(fā)射光（熒光）。

　　熒光顯微鏡一般都用高強度的汞燈做激發(fā)光源。使用濾色片把不需要的光濾去，只留下激發(fā)熒光集團的高強度很純的光線。這個單色的光線通過物鏡照射到樣本上之后，樣本會被激發(fā)出發(fā)射光（熒光），熒光和激發(fā)光都會沿著物鏡光路返回，這樣的話，就需要用一個二相色鏡把激發(fā)光濾去，只讓我們需要看到的熒光透過。

 

　　這個熒光沿著顯微鏡的光路最后到達目鏡下，然后進入我們的眼睛，我們就可以看到熒光基團所發(fā)出來的熒光了。

　　熒光顯微鏡的預(yù)檢查和調(diào)節(jié)：

　　(1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設(shè)置等狀況。

　　(2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中，熒光顯微鏡物鏡配置是否得當(dāng)，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。

　　(3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。

　　(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。

　　(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。

　　(6)電壓不穩(wěn)會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源加配穩(wěn)壓器。

　　(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關(guān)閉；汞燈熒光電源一旦關(guān)閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài)，否則會影響燈的壽命。

　　熒光顯微鏡的像觀察：

　　(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，裝載樣品進行觀察；為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會造成樣品熒光淬滅，先通過縮小熒光顯微鏡的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強度，有規(guī)律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調(diào)節(jié)到熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。

　　(2)鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調(diào)節(jié)措施是：

　　①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。

　?、谥匦抡{(diào)節(jié)熒光顯微鏡的收光器對焦和孔徑光闌大小。

　?、奂毿恼{(diào)節(jié)熒光顯微鏡物鏡覆蓋差校正環(huán)。

　　熒光顯微鏡的應(yīng)用要點

　　熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發(fā)波長在肉眼所看不見的近紫外光區(qū)(320～400nm)，熒光的發(fā)射光譜也較普通光鏡光源的平均波長短，光學(xué)分辨率提高。高能量的光子與電子碰撞，使得電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定，會重新回落到基態(tài)，這個過程中會消耗部分熱能，并發(fā)出新的光子。新的光子能量比起初的光子能量低，因此波長更長。由于新的光子波長區(qū)別于入射光的光子波長，通過一定的光學(xué)處理方法將兩束不同波長的光分開，從而使我們只看到發(fā)射出來的新光子（熒光信號），也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。

熒光顯微鏡 熒光顯微鏡的原理及應(yīng)用如何？_熒光顯微鏡 　　生物顯微鏡是用來觀察生物切片、生物細胞、細菌以及活體組織培養(yǎng)、流質(zhì)沉淀等的觀察和研究，同時可以觀察其他透明或者半透明物體以及粉末、細小顆粒等物體。左圖所示為生產(chǎn)的倒置生物顯微鏡型，該生物顯微鏡也是食品廠、飲用水廠辦QS、HACCP認證的必備檢驗設(shè)備。

　使用方法

先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標本，再用細調(diào)對準焦距進行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在zui高點。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以控制射入光線的量，整理增加明暗差。


生物顯微鏡是由精密的機械和光學(xué)鏡頭組成的，由于各種材料熱膨脹系數(shù)不同，所以顯微鏡不能在陽光下曝曬，也不能放在靠近火爐和暖氣的地方。只能室溫存放，其工作的溫度范圍一般為5℃～40℃。

　二、生物顯微鏡防潮

生物顯微鏡如果長期受潮，透鏡很容易發(fā)霉，表面還會腐蝕，所以應(yīng)在干燥環(huán)境下保存。在31℃時濕度不得>80%，溫度每升高3℃，相對濕度要設(shè)法降低10%。

　三、生物顯微鏡防塵

生物顯微鏡灰塵不僅會影響成像質(zhì)量，而且灰塵中往往也帶有含酸、堿等腐蝕性的塵粒，容易腐蝕鏡面。而硬度大的塵粒在擦拭鏡頭時還可能在鏡面上劃出傷痕，損壞鏡頭。此外，灰塵掉進機械活動部分時容易造成機械部分轉(zhuǎn)動不靈活，甚至損壞。

　四、生物顯微鏡防腐蝕

生物顯微鏡不可與腐蝕性酸類、堿類或揮發(fā)性強的化學(xué)藥品放在一起，以免被腐蝕，縮短使用年限。原則上，當(dāng)觀察含液體的標本時，一般都要蓋上蓋玻片；若液體中含有酸、堿等腐蝕性化學(xué)物質(zhì)時，應(yīng)把蓋玻片的四周用石蠟或凡士林封住，然后觀察。但由于進行中藥顯微鑒定時，經(jīng)常要用這一類試劑，不可能都封固，因此要特別小心，防止液體流到載物臺上，更不要沾到物鏡上。

五、生物顯微鏡防震

生物顯微鏡是精密儀器，劇烈的震動會造成精密度的降低。要輕拿輕放，擱置要平穩(wěn)，使用時動作應(yīng)輕柔。

六、生物顯微鏡擦拭

1、機械裝置的擦拭

機械裝置如有污漬，可用干凈的柔軟細布擦拭;如果擦不掉，可用擦鏡紙或細綢布蘸少量二甲苯擦拭。應(yīng)注意不能用酒精、乙醚等化學(xué)品，以免腐蝕裝置表面的油漆。拭去銹和油膩(不得用乙醇，因為這些溶劑會侵蝕油漆)，再用少許液體石服潤滑；旋扭過緊不要強行扭動，以免損壞。

2、光學(xué)鏡頭的擦拭

一般采用先吹、后刷、再擦拭的方法。吹，就是用吹氣球(或用洗耳球)吹掉鏡頭表面的附著物，但不能用口直接吹氣。吹不掉時，可用干凈的專用清潔毛刷輕輕地刷。經(jīng)上述兩種方法處理后鏡頭表面仍有污物時，用擦鏡紙稍蘸一點二甲苯輕輕擦拭。如果發(fā)現(xiàn)鏡頭發(fā)霉長霧時，可用擦鏡紙蘸少許無水酒精和乙醚的混合液擦拭，但液體不能太多，停留時間要短，以免滲入鏡頭內(nèi)部造成腐蝕。 油鏡頭每次用過后要及時擦拭，先用干擦鏡紙擦一兩次，把大部分介質(zhì)油去掉，再用二甲苯滴濕擦鏡紙擦兩次，zui后再用干擦鏡紙擦一次。

　　七、生物顯微鏡其他

(1)、生物顯微鏡光學(xué)鏡頭表面不可用手觸摸，以免污染。具有張力作用的器件使用完畢后要讓它回到自然松弛狀態(tài)。任何可調(diào)節(jié)的部位都不要讓它處于極端位置。電源開關(guān)不要短時內(nèi)頻繁開關(guān)。顯微鏡使用間歇中要調(diào)低照明亮度。

(2)、決不可把標本長時間留放在載物臺上，特別是有揮發(fā)性物質(zhì)時更應(yīng)注意這一點。

(3)、在每次關(guān)閉顯微鏡電源之前．應(yīng)該把顯微鏡燈光由亮調(diào)至zui暗。關(guān)閉顯微鏡電源后．須等燈箱完全冷卻之后(大概20 min)再罩上顯微鏡防塵透氣罩。開啟顯微鏡電源后，先將顯微鏡燈光調(diào)至zui暗，以免損壞燈泡和電子元器件短路。

(4)、虹膜應(yīng)該經(jīng)常注意避免生銹和油淬火,有點酸免費凡士林或必要時油提取溶解脂肪陳后再抹拭干凈的油。

(5)、齒輪齒條的油、油脂和滑槽面——死一整天灰塵、污垢或硬化,硬厚旋轉(zhuǎn)手輪,去除脂肪陳二甲苯可用,然后穿上一點凡士林,沒有酸動物脂肪或酸,不與其他任何油,以免影響儀器。

(6)、物鏡的內(nèi)部應(yīng)定期檢查,與虎皮吹灰規(guī)模（耳朵注射器）。在必要的時候仔細抹拭,抹拭鏡子用棍子（一些棉花球或紙輕輕抹拭,在必要的時候,可以用一個小蘸油香精或二甲苯,zui后與污垢。