液相色譜使用較多的是紫外檢測(cè)器,為了使一些沒(méi)有紫外吸收或紫外吸收很弱的化合物能被紫外檢測(cè)器檢測(cè),往往通過(guò)衍生化反應(yīng)在這些化合物的分子中引入有強(qiáng)紫外吸收的基團(tuán):2,4-二硝基苯、苯甲基、對(duì)硝基苯甲基、3,5-二硝基苯甲基、苯甲酸酯、對(duì)甲苯酰、對(duì)氯苯甲酸制、對(duì)硝基苯甲酸酯、對(duì)甲氧基苯甲酸酯、苯甲酰甲基、對(duì)溴苯甲酰甲基,這些衍生物可被紫外檢測(cè)器檢測(cè)。
大多數(shù)紫外衍生反應(yīng)來(lái)自經(jīng)典的光度分析和有機(jī)定量分析,新的衍生化反應(yīng)和衍生化試劑是隨液相發(fā)展而發(fā)展的,這些反應(yīng)的原理都來(lái)自有機(jī)合成,所以就要求操作者對(duì)有機(jī)合成有所了解。但是,由于柱前衍生化是為色譜分析準(zhǔn)備樣品,處理樣品的量?。╩g級(jí)),所用的小型和微型反應(yīng)器皿又不同于常量的有機(jī)合成,而是類似于近年來(lái)發(fā)展的微量有機(jī)合成。紫外衍生化反應(yīng)要選擇反應(yīng)產(chǎn)率高、重復(fù)性好的反應(yīng)。過(guò)量試劑和試劑中的雜質(zhì)如果干擾下一步的色譜分離和檢測(cè),則在色譜進(jìn)樣前要進(jìn)行純化分離。還要注意反應(yīng)介質(zhì)對(duì)紫外吸收的影響。
(1)苯甲酰化反應(yīng):苯甲酰氯及其衍生物--對(duì)硝基苯甲酰氯、3,5-二甲基苯甲酰氯和對(duì)甲氧基苯甲酰氯都可以同胺、醇和酚類化合物反應(yīng),生成紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物;
(2)2,4-二硝基氟代苯(DNFB)的反應(yīng):DNFB與醇的反應(yīng)產(chǎn)率很低,但可與大多數(shù)伯胺、仲胺和氨基酸反應(yīng),生成強(qiáng)紫外吸收的苯胺類衍生物;
(3)苯基異硫氰酸酯(PITC)的反應(yīng):PITC可與氨基酸反應(yīng),生成苯基己丙酰硫脲衍生物--PTH氨基酸;
(4)苯基磺酰氯的反應(yīng):苯基磺酰氯可與伯胺和仲胺反應(yīng)。
甲苯磺酰氯可與多氨基化合物反應(yīng),不僅能提高它們的檢測(cè)靈敏度,還可改變HPLC的分離度。
(5)有機(jī)酸的酯化反應(yīng):有機(jī)酸很容易與酰溴基反應(yīng)生成酯,常用的酰溴基試劑有苯甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、對(duì)溴基苯甲酰溴和對(duì)硝基苯甲酰溴等;
酯化反應(yīng)在極性溶劑(如乙腈、丙酮或四氫呋喃)中進(jìn)行,有時(shí)需要加催化劑,如冠醚加鉀離子、二乙胺或N-二異丙基胺等。
(6)羰羥基化合物的反應(yīng):醛類和酮類中的羰基可與2,4-二硝基苯肼(DNPA)反應(yīng),反應(yīng)在弱酸性條件下進(jìn)行,生成苯腙衍生物。
羰基化合物還可以與對(duì)甲基芐基羥胺(PNBA)在堿催化下反應(yīng),生成有強(qiáng)紫外吸收的肟。
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在食品分析中,無(wú)論是殘留分析還是成分分析,HPLC 也已成為不可或缺的。流動(dòng)相脫氣是HPLC 系統(tǒng)能得到可靠數(shù)據(jù)的一個(gè)很有效的措施。下面分析一下,高效液相色譜脫氣的必要性,并總結(jié)歸納了脫氣常用的方法。
一、脫氣的必要性
流動(dòng)相脫氣是HPLC 系統(tǒng)能得到可靠數(shù)據(jù)的一個(gè)很有效的措施。HPLC 泵在輸送液體時(shí)要產(chǎn)生很大的力量,由于氣體的壓縮比與液體相比大的多,因而當(dāng)氣泡存在時(shí),我們發(fā)現(xiàn)瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。如果這個(gè)氣泡足夠大,液相泵將不能輸送任何溶劑,而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限,泵將停止工作。當(dāng)一個(gè)氣泡通過(guò)輸液泵時(shí),由于系統(tǒng)壓力大,氣泡通常會(huì)溶解在流動(dòng)相溶液中,隨流動(dòng)相通過(guò)柱子。但是到達(dá)檢測(cè)器流通池時(shí)系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓,因而氣泡可能在檢測(cè)器流通池中又顯現(xiàn),在色譜圖上會(huì)出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。
二、脫氣方法
1、吹氦脫氣法。
利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性,在0.1MPa 壓力下,以約60 mL/min 流速通入流動(dòng)相儲(chǔ)液容器中10~15min,可以很有效地從流動(dòng)相中排除溶解的空氣,能排除接近80%的氧氣。采用一個(gè)高效分布式噴射流裝置,一體積的氦氣可從流動(dòng)相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L 氦氣通過(guò)1L 流動(dòng)相就可完成排氣這個(gè)工作。這種脫氣方法雖然好,但氦氣價(jià)格較高,很少使用。
2、加熱回流法。
此法的脫氣效果較好。在操作時(shí)要注意冷凝塔的冷卻效率,否則溶劑會(huì)丟失,混合流動(dòng)相的比例會(huì)有變化。
3、抽真空脫氣法。
此法可使用真空泵,降壓至0.05~0.07MPa ,即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會(huì)使混合溶劑組成發(fā)生變化,從而影響到實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性,因此多用于單溶劑體系的簡(jiǎn)單分析。
4、超聲波脫氣法。
將欲脫氣的流動(dòng)相置于超聲波清洗機(jī)中,用超聲波震蕩10~20min。此法的脫氣效果最差。