煙草中的水溶性糖,特別是還原糖是影響煙草吸味的重要化學(xué)成分之一,目前煙草中的還原糖和總糖的測定方法主要有氧化還原滴定法,分光光度法,連續(xù)流動分析和高效液相色譜法等。液相色譜法是較為可靠的方法,但其樣品前處理比較麻煩,且流動相和提取溶劑的不一致會導(dǎo)致示差折光檢測器有很大的溶劑峰而干擾分析。我們首次用WatersSugar-Pak1鈣型陽離子交換柱分離測定了煙草樣品中的4種糖,并建立了用水超聲浸取,固相萃取預(yù)分離的樣品前處理
方法,獲得了滿意結(jié)果。
主要儀器和試劑　高效液相色譜儀
色譜條件　色譜柱
流動相為: 0.05 g/L EDTA
樣品處理　

準(zhǔn)確稱取煙草樣品約0.500 g,用50 mL水在40~50℃下超聲萃取40 min,過濾,棄去最初的約10mL濾液,收集后面的濾液。取5 mL濾液通過預(yù)活化好的Sep-PakC18固相萃取小柱,棄去最初的2 mL,收集后面的3mL用4.5μm濾膜過濾,取20μL進樣分析。
結(jié)果
實驗條件選擇　實驗選用示差折光檢測器檢測。鈣型陽離子交換柱為分離糖和多羥基化合物專用柱,該柱用0.05g/LEDTA鈣鈉水溶液作流動相,柱溫要求控制在80~90℃之間,實驗選用85℃。
樣品前處理　由于4種糖都易溶于水,所以實驗選用水超聲浸取的方法,室溫下糖溶出慢,升高溫度可加速糖的溶出,但溫度過高（超過60℃）會加快多糖,蔗糖和麥芽糖水解;故實驗選擇浸取溫度40~50℃,在該溫度下超聲浸取30min以上可使糖完全溶出,實驗選用超聲浸取40min。糖提取液可以當(dāng)天測定,如放置過夜會導(dǎo)致葡萄糖測定結(jié)果稍有偏高。

煙草樣品提取液中除了糖外,還含有少量其它雜質(zhì)成分,會污染色譜柱而降低柱效,所以在進樣之前要預(yù)分離這些成分。我們采用Sep-PakC18固相萃取小柱預(yù)固相萃取和用Sep-Pak Alumin Cartridges保護柱在線分離可有效地除去雜
質(zhì)成分。

用鈣型陽離子交換柱高效液相色譜法測定煙草樣品中的糖,并用水超聲浸取提取樣品中的糖,方法簡便快速,結(jié)果可靠,樣品可實現(xiàn)批量處理,可滿足大量樣品分析的要求,提高了工作效率。方法用于幾種煙樣分析,各糖回收率在96%~104%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.98%~1.36%之間。結(jié)果令人滿意。

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一、液相色譜理論發(fā)展簡況

色譜法的分離原理是：
溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從定相中流出。又稱為色層法、層析法。

色譜法比較早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。

二、HPLC的特點和優(yōu)點
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HPLC有以下特點：

高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。

高速——流速為0.1~10.0 ml/min。

高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：
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速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。

分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到較佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。

柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

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