不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤(rùn)填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤(rùn)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。
2. 使用PEEK(polyetheretherketone)管路和接頭需要注意什么問題？
如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。
使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi(但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi)。
使用PEEK接頭時(shí)則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。
3. 如何預(yù)防液相泵的故障:
要保持泵的良好操作性能,必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施:
1)、用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑；
2)、過濾流動(dòng)相和溶劑；
3)、脫氣；
4)、每天開始使用時(shí)放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液；
5)、不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中；
6)、定期更換墊圈；
7)、需要時(shí)加潤(rùn)滑油；
8)、查閱有關(guān)泵操作手冊(cè)中的其它建議。
處于良好操作狀態(tài)的泵，應(yīng)該能使色譜圖上的基線平穩(wěn)；保留時(shí)間的重復(fù)性好。在等度洗脫時(shí)壓力波動(dòng)小于2%。梯度洗脫時(shí)壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。
為了使故障發(fā)生后盡快排除，平時(shí)應(yīng)常備密封、單向閥(入口與出口)、泵頭裝置、各式接頭、保險(xiǎn)絲等部件，以及更換工具。
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自動(dòng)進(jìn)樣器的故障容易被發(fā)現(xiàn)，有時(shí)液相色譜儀系統(tǒng)出了故障而不能確定是否是進(jìn)樣器故障，可以用手動(dòng)進(jìn)樣幾次，或用一臺(tái)好的自動(dòng)進(jìn)樣器代替，如排除了故障，說明自動(dòng)進(jìn)樣器有了問題。不同廠商的自動(dòng)進(jìn)樣器差異很大，除一些共性故障外，較好查閱操作手冊(cè)。
除自動(dòng)進(jìn)樣器機(jī)械、控制系統(tǒng)可能出現(xiàn)故障外，在操作及方法學(xué)方面也可能出現(xiàn)相應(yīng)的問題，這里主要根據(jù)自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)特點(diǎn)，對(duì)試驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的問題進(jìn)行說明。
一、滯后體積
高效液相色譜儀中滯后體積是指流動(dòng)相混合器到柱頭的體積，包括溶劑混合器和混合器到柱頭之間連接管的體積，對(duì)于低壓混合系統(tǒng)，也包括泵體積。滯后體積較大可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差、方法移植困難。通常的HPLC系統(tǒng)中，滯后體積一般在0.2mL～5mL之間，主要取決于裝置的設(shè)計(jì)。
滯后體積中較重要的部分為自動(dòng)進(jìn)樣器的定量環(huán)體積。只有定量環(huán)體積小于100μL時(shí)，其對(duì)滯后體積的影響才可以近似不計(jì)。當(dāng)定量環(huán)體積較大時(shí)，這種影響將表現(xiàn)出來。例如，采用50μL的定量環(huán)時(shí)滯后體積為300μL，如果改用1mL定量環(huán)，滯后體積將變成1250μL，這種變化直接影響到色譜分離結(jié)果。在實(shí)際分離過程中，采用的色譜柱較細(xì)時(shí)，必須考慮滯后體積的影響，解決的辦法為更換較小的定量環(huán)，減小滯后體積。
二、樣品瓶過滿
如果樣品瓶過滿，在瓶蓋較緊、進(jìn)樣量較大的情況下，可能會(huì)導(dǎo)致進(jìn)樣重復(fù)性變差。其原因?yàn)闃悠菲恐械臉悠繁怀槌鰰r(shí)，蓋緊的瓶蓋不能使空氣及時(shí)進(jìn)入，造成部分真空。由于這種真空作用，注射器不能夠吸取足夠量的樣品體積。在極端的情況下，對(duì)于揮發(fā)性稀溶液樣品，針內(nèi)甚至?xí)霈F(xiàn)氣泡，影響分析工作的正常進(jìn)行。
有些自動(dòng)進(jìn)樣器采用加排空針的方法克服這一問題，但這種方法并不常用。較簡(jiǎn)單的解決辦法為不要使樣品瓶過滿。一般裝樣量在樣品瓶的1／2到3／4之間較為適宜。
三、進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)
樣品量足夠多時(shí)，不必考慮這一問題。但對(duì)于痕量分析而言，進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)問題將較為突出。理想的情況下可以使進(jìn)針深入到接近樣品瓶底部，這樣可以較大限度地利用樣品。當(dāng)可用的樣品體積有限時(shí)，可以采用微量樣品瓶以增加給定體積樣品的相對(duì)深度。如果進(jìn)針過深，可能插入樣品瓶的底部，甚至導(dǎo)致針尖阻塞。如果進(jìn)針深度不足，樣品只及針尖部分，針將不能抽取足夠量的樣品，部分空氣取而代之。
對(duì)于進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)，一般采用機(jī)械或電動(dòng)的方法，目前大部分廠商可以在液相色譜儀色譜工作站上設(shè)置。無論采用哪種方法，實(shí)驗(yàn)之前都必須認(rèn)真調(diào)節(jié)，更換樣品瓶類型時(shí)還需要重新調(diào)整。
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