1、流動相
在以水溶液為流動相時,水溶液中的微生物例如細菌容易生長,當用水溶液或有機酸緩沖液保護柱子時,一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術的問世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動相的pH值對色譜柱也有影響,特別是對化學鍵合硅膠填料,水溶液的pH最適范圍在2~7.5之間,當pH>8時,硅膠會釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復原,柱效很快降低,甚至完全失效。當在緩沖液中加入有機溶劑例如甲醇或乙腈時,鹽類的溶解度下降,會析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時流動相中的有機溶劑和鹽會腐蝕色譜柱頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動相的極性對柱子也有一定影響,對于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會破壞填料,反之,對于化學鍵合硅膠,極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
2、樣品和固定相
如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動相中,在通過固定相會堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過柱子時會產(chǎn)生不可逆吸附,這樣固定相的活性點被覆蓋。樣品組分還會與固定相產(chǎn)生反應,尤其是對于氨基柱的影響較為嚴重,因為氨基易與酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少活性點,使保留時間縮短。色譜柱鍵合相基團脫落、固定相分解和活性基團變性以及會影響柱效和保留時間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過硅氧硅鍵(Si-O-Si)連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機基團的固定相Si-O-Si-R(R為CnH2n+1),硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團脫落。
色譜柱的使用壽命,除了與所分析的樣品和流動相及使用頻率有關系外,最主要的是與日常的維護密切相關。色譜柱的使用壽命主要是柱效和柱壓兩個指標來衡量,如果一支色譜柱柱效太低或柱壓太高,通常被認為該色譜柱已經(jīng)結束。因此,延長色譜柱使用壽命的關鍵是,消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的維護方法:
一、流動相的PH應在使用的范圍內(nèi)
流動相超過其PH范圍將會導致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂,使柱效下降,使用壽命變短。由于流動相的PH控制不當而對色譜柱造成的損害,通常很難是色譜柱恢復,因此必須認真對待,嚴格控制流動相的PH值。
二、去除樣品和流動相中的固體顆粒
樣品和流動相中含有的固體顆粒物質(zhì)會堵塞色譜柱篩板,篩板被堵住不僅會引起柱壓的升高,而且也會引起柱效下降,因為篩板的堵塞會引起液流不均,導致色譜峰型拖尾、變寬,從而使柱效下降。因此,建議使用超純水和色譜純試劑,在分析樣品前對樣品進行針筒過濾,流動相過0、45μm濾膜。
三、使用保護柱或在線過濾器
樣品和流動相經(jīng)過濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì),因為泵的磨損、密封圈和管路的老化也會產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì),這些固體顆粒被流動相帶入色譜柱,堵塞篩板,導致柱壓升高、柱效下降。保護柱和在線過濾器上都有篩板,其孔徑與色譜柱孔徑相同,因此可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達色譜柱,有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例,因此,除對樣品和流動相進行過濾外,建議您在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器。
如果色譜柱柱壓升高是由于進樣端篩板被堵引起的,可選擇以下方式進行補救:
1、先在色譜柱前加上保護柱或在線過濾器,然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min、
2、先在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器,然后反向使用。
四、正確使用緩沖鹽
緩沖鹽通常易溶于水,難溶于有機溶劑,因此緩沖鹽使用不當會使其析出,堵塞填料基質(zhì)上的微孔和顆粒間的空隙,使填料板結,柱壓上升;同時阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈自由舒展,使色譜柱的保留能力下降,柱效降低。緩沖鹽析出后,去除非常困難,因此,正確的使用緩沖鹽對延長色譜柱使用壽命非常重要。
正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出,因此正確使用緩沖鹽的方法可歸結為一句話:使用前要過濾,使用后要沖洗。具體方法如下:
1、等度條件:使用緩沖鹽前和使用后需用過渡流動相以1、0ml/min流速沖洗60min;使用后去除緩沖鹽的另一個方法是用過渡流動相以0、2ml/min流速沖洗色譜柱過夜。
2、梯度條件:用含有緩沖鹽的流動相跑梯度之前,用與初始流動相組成相同的過渡流動相以1、0ml/min流速沖洗60min,再用該過渡流動相以1、0ml/min沖洗色譜柱120min。含緩沖鹽流動相的梯度設定應盡量平緩,以避免梯度過程中緩沖鹽析出。
注意:過渡流動相是指有機相和水相的組成與分析流動相相同,區(qū)別只是過渡流動相不含緩沖鹽。
3、緩沖鹽析出的補救方法:
方案1:用甲醇/20/80以1、0ml/min流速35攝氏度條件下反向沖洗色譜柱120min
方案2:用甲醇/水=20/80以0、2ml/min流速反向沖洗色譜柱過夜。
五、防止強保留物質(zhì)在色譜柱上存留
強保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積,對樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為,不僅引起峰型變寬、拖尾,使柱效下降,同時也會引起保留時間的變化,累積到一定程度時還會導致柱壓升高。由于強保留物質(zhì)和大分子化合物對色譜分離的影響是一個累積效應,需要一定的時間才會體現(xiàn)出來,但對許多藥品特別是復雜樣品而言,很難判斷其是否是含有強保留物質(zhì),因此要防止強保留物質(zhì)的累積,需要在每天的日常維護中用純甲醇或乙氰清洗色譜柱。
1、反相柱
分別用甲醇:水=90:10、純甲醇、二氯甲烷等溶劑著流動相,依次沖洗,每種流動相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的色譜柱體積。然后再以相反的次序沖洗。
2、正相柱
分別用正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇等溶劑做流動相,順次沖洗,每種流動相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的柱體積(異丙醇粘度大,可降低流速,避免壓力過高)。注意使用溶劑的次序不要顛倒,用甲醇沖洗完后,再以相反的次序沖洗至正己烷。所有的流動相必須嚴格脫水。
3、離子交換柱
長時間在緩沖溶液中使用和進樣,將導致色譜柱離子交換能力下降,。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生,反之,用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
用戶還可以選擇能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑為流動相做正方向和反方向沖洗。但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復到新柱的水平的。
如果柱子裝反了,可以調(diào)回來,但可能會造成柱內(nèi)擔體塌陷。在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。
下一篇:恒溫水浴的操作使用及注意事項