一．開機程序
1．檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。
2．打開儲液箱，倒掉廢液,
并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。
3．將FACSCalibur開關(guān)打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY，預(yù)熱5－10分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。
4．如果需要打印，打開打印機電源。
5．打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。
6．執(zhí)行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。
7．分析樣品時，先用FACAFlow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。
做過分選后，每次開機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止
后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。
二．預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)
1．從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。
2．選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當?shù)膞軸和y軸參數(shù)。
3．選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。
4．將此視窗命名后儲存于FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP文件夾中，下次進行相同實驗時可直接調(diào)用。
本計算機中已設(shè)定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3BD Applications CELLQuest EXP文件夾中，ACQ用于細胞DNA檢測，EXP用于細胞表面標志分析。
三．用CELLQuest進行儀器的設(shè)定和調(diào)整
1．從蘋果畫面中選取CELLQuest，進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。
2．從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵： ＋B)進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對話框移至合適位置。
3．從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個對話框。
4．在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數(shù)選擇適當?shù)谋对瞿Ｊ?amplifier mode)：線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時，F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對數(shù)模式Log測量；分析細胞DNA含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進行測量，且DDM Param選擇FL2；分析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log進行測量。
5．放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設(shè)定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。
6．在Acquisiton
Control對話框中，選取Acquire，開始獲取細胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉SETUP前的“?”。
7．在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages(粗調(diào))與Amp Gains(細調(diào))，使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC點圖內(nèi),且三群細胞合理分布。
8．在Threshold
對話框中選擇適當?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold，并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時用FSC－H而做DNA時用FL2－H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質(zhì)量。
9．從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域)，并在靶細胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調(diào)整更為容易。
10．Detectors/Amps對話框中，調(diào)整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。
11．在Compensation對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補償用標準熒光樣品調(diào)整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如應(yīng)該為FL1+ FL2-
的細胞群卻分布在FL1＋ FL2＋區(qū)域內(nèi)，則需調(diào)大FL2－？％FL1中的“？”，并從FL1-FL2點圖中觀察新的調(diào)整是否恰當
12．在Status對話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW；Laser current:正常值為6Amps左右。
13．調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進行相同實驗時可調(diào)出使用，屆時只需微調(diào)即可。
本計算機中已有三個名叫儲存于FACStation G3 BD Applications CELLQuest FolderIMM-InstrSettings及FACStation G3 BD Files Instrument Settings FilesCalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。
1、DNA倍體分析 DNA分析是流式細胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用廣泛檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現(xiàn)有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學(xué)中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并發(fā)射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。 在該領(lǐng)域Partec公司的 CyFlow PA是一枝獨秀。 2、細胞生存能力實驗 使用Heochest 33342染料與DNA特異性結(jié)合，后因細胞活力不同染料的結(jié)合程度也各異，故可評估細胞的活性度?！ ?、計數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細胞 使用TO染料能夠特異性地與RNA結(jié)合，結(jié)合系數(shù)高達3000，故具有很好的性價比?！ ?、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數(shù)，臨床上用于骨髓移植前干細胞數(shù)理的測定。使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。 5、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗 檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應(yīng)有著重要臨床意義，因為這種反應(yīng)會導(dǎo)致移植后發(fā)熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結(jié)合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。 6、血小板自身抗體檢測 血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體?！ ?、移植交叉配型 原細胞毒實驗，主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細胞儀用于監(jiān)測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預(yù)實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體?！ ?、檢測細胞經(jīng)抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監(jiān)測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體?！ ?、細胞增殖狀態(tài)檢測 核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標志物的檢測一般同細胞表面標志物同時檢測。FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標記細胞表面標志物?！ ?0、染色體分析 流式細胞儀染色分析運用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結(jié)合；Chromomycin A3與GC相結(jié)合。從而在雙參數(shù)坐標上根據(jù)染色體ATCG含量的不同識別各種染色體。平時進行的染色體分析耗時且需要操作者極具經(jīng)驗，而用流式細胞儀時可快速地識別出異常染色體，如加配分選系統(tǒng)可將這些異常染色體分選出來作進一步分析。
1、1934年，Moldavan使懸浮的紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來。這就是流式細胞儀的雛形。 2、1965年，Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色細胞，給出細胞中核酸的含量和細胞大小。奠定了多參數(shù)流式細胞測量的基礎(chǔ)?！ ?、1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了層流流動室和氬激光器，開發(fā)出了液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者相互垂直的流式細胞儀。這成為目前各種流式細胞儀的基礎(chǔ)?！ ?、1969年，F(xiàn)ulwyler利用靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細胞儀變成了低分辨率的流式細胞儀。 5、20世紀70年代，隨著Kohler和Milstein成功提出了單克隆抗體技術(shù)和熒光標記技術(shù)，為特異研究和分析細胞奠定了良好的基礎(chǔ)?！ ?、1973年，美國BD公司和美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界上第一臺商用流式細胞儀FACS I。 7、20世紀80年代，流式細胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增加，新的熒光染料和細胞標記物的出現(xiàn)，使流式細胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大?！ ?、20世紀90年代，與之配套的標本制備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀逐漸從科研單位進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科，成為現(xiàn)代化的臨床檢驗儀器的一部分。
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