分光光度計所采用的分光光度法在定量分析領(lǐng)域中的應(yīng)用已有數(shù)十年的歷史,至今仍是實驗室中經(jīng)常用的分析方法之一。隨著現(xiàn)代科學(xué)儀器的不斷發(fā)展,在傳統(tǒng)的追求準(zhǔn)確、快速、可靠的同時,小型化、智能化、在線化、網(wǎng)絡(luò)化成為了現(xiàn)代可見分光光度計新的增長點。
結(jié)構(gòu)組成
分光光度計的基本組成和大多數(shù)分光光度計一樣,都是由光源、單色器、比色池、光電檢測器和放大器幾部分組成。
1.光源
分光光度計的可見區(qū)的光源仍是采用鹵素鎢燈和氘燈。鹵素鎢燈的工作波長范圍為:320～2500nm,氘燈的工作波長范圍為180～375nm。兩光源有儀器上的一個燈選擇反射鏡自動進行選擇和光源切換。
1.2單色器(分光系統(tǒng))
單色器是分光光度計的重要部分,比濾光片選擇波長能更有效地提供帶寬窄的單色光。是采用先進的光柵單色器,由入射狹縫、出口狹縫、色散元件、準(zhǔn)直鏡等光學(xué)元件組成。入射狹縫是用來調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強度，也直接影響分辨率。而準(zhǔn)直鏡(反射凹面鏡)的作用一是將入射光束變?yōu)槠叫泄馐笤龠M入色散元件，二是把來自色散元件的平行光束聚焦于出口狹縫上,形成光譜像。出口狹縫是單色光的出口，它只讓光譜帶中所需要波長的光從狹縫中透出，而將其他波長的光擋住,不讓其通過。
色散元件是單色器中的核心元件，起著將復(fù)合光分解為單色光的作用。分光光度計的色散元件是凹面反射式全息光柵,它本身就起著分解復(fù)合光和準(zhǔn)直鏡(聚焦)的作用,而且全息光柵具有雜散光小、不產(chǎn)生偽線和分辨率高的優(yōu)點。
1.3比色池
分光光度計配有多種規(guī)格樣品池架和比色杯。池架有標(biāo)準(zhǔn)池架、七位池架、50霯微量池架和多形態(tài)樣品池架。比色杯有常量(2～4mL)、半微量(0.5～1mL)和微量(50～100霯),使用方便。另外還配有樣品架卡套,分為特為酶動力學(xué)設(shè)計的半導(dǎo)體溫控池:溫度范圍15～50℃,和流動池。
正確使用分光光度計
分光光度計操作簡便。
打開儀器電源開關(guān)，儀器應(yīng)順利通過自檢，然后預(yù)熱10分鐘左右，可以進行測定。讀數(shù)時應(yīng)記錄最先顯示的數(shù)值，不要讓樣品連續(xù)光照時間太長(動力學(xué)測定除外)，特別是在紫外區(qū)域測定時更要快速，因為隨著光的連續(xù)照射讀數(shù)會下降，變得不穩(wěn)定。而應(yīng)用顯色劑顯色后會使讀數(shù)穩(wěn)定，給測定帶來方便，同時還會使物質(zhì)中許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來的幾萬提高到數(shù)十萬，明顯提高了檢測靈敏度。
作為一種分子吸收光譜儀,廣泛應(yīng)用于化學(xué)研究、生物醫(yī)藥、環(huán)境科學(xué)和食品分析等研究領(lǐng)域。它具有分析精度高、應(yīng)用范圍廣、分析簡便快速和儀器靈敏度較高的優(yōu)點,是目前大多數(shù)實驗室常用的定量分析儀器。
分光光度計計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
分光光度計的基本工作原理
分光光度計的基本工作原理是基于物質(zhì)對光（對光的波長）的吸收具有選擇性，不同的物質(zhì)都有各自的吸收光帶，所以，當(dāng)光色散后的光譜通過某一溶液時，其中某些波長的光線就會被溶液吸收。在一定的波長下，溶液中物質(zhì)的濃度與光能量減弱的程度有一定的比例關(guān)系，即符合比爾定律。
T=I/Iolg（Io/I）=εcb
式中，T為透過率，Io為入射光強度，I為透射光強度，A為消光值（吸光度），ε為吸收系數(shù)，b為溶液的光徑長度，c為溶液的濃度。從以上公式可以看出，當(dāng)入射光、吸收系數(shù)和溶液厚度一定時，透光率是根據(jù)溶液的濃度而變化的。
在使用分光光度計時，我們必須要注意一些使用后的維護，保養(yǎng)，和一些基本使用注意事項，才能達到更好的使用效果。
分光光度計的使用維護：
1、使用的吸收池必須潔凈，并注意配對使用。量瓶、移液吸管均應(yīng)校正、洗凈后使用。
2、取吸收池時，手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝盛樣品以池體的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無溶劑殘留。吸收池放入樣品室時應(yīng)注意方向相同。用后用溶劑或水沖洗干凈，晾干防塵保存。
3、供試品溶液濃度除各該品種已有注明外，其吸收度以在0.3～0.7之間為宜。
4、測定時除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰±2nm以內(nèi)，測幾個點的吸收度或由儀器在規(guī)定的波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸收度最大的波長作為測定波長，除另有規(guī)定外吸收度最大波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的測定波長±2nm以內(nèi)。
5、供試品應(yīng)取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應(yīng)取2份。平行操作，每份結(jié)果對平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。
6、選用儀器的狹縫寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度值會偏低，狹縫寬度的選擇應(yīng)以減少狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)，對于大部分被測品種，可以使用2nm縫寬。
7、單色器是儀器的核心部分,裝在密封盒內(nèi)不能拆開,為防止色散元件受潮發(fā)霉,必須經(jīng)常更換單色器盒干燥劑。
8、光電轉(zhuǎn)換元件不能長時間曝光,應(yīng)避免強光照射或受潮積塵。
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