如何正確的選擇毛細(xì)管色譜柱
1、柱長(zhǎng)度的選擇
分辨率與柱長(zhǎng)的平方根成正比。在其他條件不變的情況下,為取得加倍的分辨率需有4倍的柱長(zhǎng)。較短的柱子適于較簡(jiǎn)單的樣品,尤其是由那些在結(jié)構(gòu)、極性和揮發(fā)性上相差較大的組分組成的樣品。
一般來說：
15m的短柱用于快速分離較簡(jiǎn)單的樣品，也適于掃描分析；
30m的色譜柱是zui常用的柱長(zhǎng)，大多數(shù)分析在此長(zhǎng)度的柱子上完成；
50m、60m或更長(zhǎng)的色譜柱用于分離比較復(fù)雜的樣品。
應(yīng)該注意，柱長(zhǎng)增加分析時(shí)間也增加。
2、柱內(nèi)徑的選擇
柱徑直接影響柱子的效率、保留特性和樣品容量。小口徑柱比大口徑柱有更高柱效，但柱容量更小。
0.25mm：具有較高的柱效，柱容量較低。分離復(fù)雜樣品較好。
0.32mm：柱效稍低于0.25mm的色譜柱，但柱容量約高60%。
0.53mm：具有類似于填充柱的柱容量，可用于分流進(jìn)樣，也可用于不分流進(jìn)樣。
當(dāng)柱容量是主要考慮因素時(shí)（如痕量分析），選擇大口徑毛細(xì)管柱較為合適。
3、液膜厚度的選擇
液膜厚度影響柱子的保留特性和柱容量。厚度增加，保留也增加。
0.1～0.2μm ：薄液膜厚度的毛細(xì)管柱比厚液膜的毛細(xì)管柱洗脫組分快，所需柱溫度低，且高溫下柱流失較小，適用高沸點(diǎn)的化合物的分析。
0.25～0.5μm ：常用的液膜厚度。
0.6～5.0μm : 厚液膜，對(duì)分析低沸點(diǎn)的化合物較為有利。
色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。
2.選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
3.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?/p>
4.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
5.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
6.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。
7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
8.保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
色譜柱的利用壽命，除了與所分析的樣品和流動(dòng)相及利用頻率有關(guān)系外，主要的是與日常的委會(huì)密切相關(guān)。為延長(zhǎng)色譜柱的利用壽命，維護(hù)您的利益，請(qǐng)仔細(xì)閱讀此部分。 色譜柱的利用壽命主要是分局柱效和柱壓兩個(gè)指標(biāo)來衡量，假設(shè)一支色譜柱柱效太低或柱壓太高，通常被認(rèn)為該色譜柱已經(jīng)結(jié)束。因此，延長(zhǎng)色譜柱利用壽命的關(guān)鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。
以下是色譜柱的日常維護(hù)點(diǎn)子：
1.流動(dòng)相的PH應(yīng)在利用的范圍內(nèi)反相色譜柱由于填料中存在Si-C和Si-O鍵，流動(dòng)相超過其PH范圍將會(huì)導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，利用壽命變短。由于流動(dòng)相的PH 控制欠妥而對(duì)色譜柱造成的損害，通常很難是色譜柱恢復(fù)，因此必須認(rèn)真對(duì)待，嚴(yán)格控制流動(dòng)相的PH值。
2.去除樣品和流動(dòng)相中的固體顆粒 樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會(huì)引起柱壓的升高，而且也會(huì)引起柱效下降，因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議利用超純水和色譜純?cè)噭?，在分析樣品前?duì)樣品進(jìn)行針筒過濾，流動(dòng)相過0.45μm濾膜。
3.利用維護(hù)柱或在線過濾器 樣品和流動(dòng)相經(jīng)過濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì)，因?yàn)楸玫哪p、密封圈和管路的老化也會(huì)產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì)，這些固體顆粒被流動(dòng)相帶入色譜柱，堵塞篩板，導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。維護(hù)柱和在線過濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此能夠阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過濾外，建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上維護(hù)柱或在線過濾器。 假設(shè)確認(rèn)色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的，可選擇以下方式進(jìn)行補(bǔ)救：
先在色譜柱前加上維護(hù)柱或在線過濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min。
先在色譜柱進(jìn)樣端加上維護(hù)柱或在線過濾器，然后反向利用。
色譜柱參數(shù)
物理性質(zhì)
柱長(zhǎng)，內(nèi)徑，如250*4.6mm。一般柱長(zhǎng)在2—250mm，柱越長(zhǎng)，分離度越高，但柱壓更高，分離所需時(shí)間更長(zhǎng);但分離度與理論塔板數(shù)的平方根成正比，所以一昧增加柱長(zhǎng)并不是比較有效的分離手段，一般情況下，150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數(shù)。
粒徑，影響色譜分離度。粒徑越小，分離越快，柱效越高，但柱壓力越高，柱容易被污染，導(dǎo)致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料，復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑，更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍，因此如何選擇填料粒徑需要根據(jù)現(xiàn)實(shí)情況而定。
孔徑，60A，120A，300A等?？讖叫?，則含孔率高，比表面積大，載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配，保證分子自由進(jìn)出填料孔并與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配，通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。
顆粒形狀，一般有球形和不規(guī)則形，當(dāng)使用黏度較大的流動(dòng)相時(shí)，球形顆?？梢越档椭鶋?，延長(zhǎng)色譜柱壽命。
苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化學(xué)穩(wěn)定，應(yīng)用pH范圍寬，具有更強(qiáng)的疏水性，對(duì)蛋白質(zhì)等樣品分離效果較好;但強(qiáng)度較小，有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物溶脹而受損，批次重復(fù)性較差，商品化色譜柱不多，一般價(jià)格較貴。
載碳量：基質(zhì)表面鍵合相的比例，載碳量高，則保留增加，適合分析非極性化合物。
鍵合相：鍵合試劑不同，對(duì)化合物的選擇性不同，一般長(zhǎng)鏈的烷基鍵合相(C18 C8)比短鏈的(C4 C3)穩(wěn)定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩(wěn)定。
封端：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來，以減少殘留的硅醇基，減輕待測(cè)組分與酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象。尤其對(duì)于極性樣品而言，未封端處理的色譜柱分離效果較差。
現(xiàn)在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目，根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個(gè)初步的選擇，但由于各個(gè)儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數(shù)，仔細(xì)閱讀色譜柱說明書，才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。
449717568
