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疏水色譜柱的影響因素有哪些 如何挑選購買色譜柱

時(shí)間:2020-07-22    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
疏水色譜柱是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同,用流動(dòng)相洗脫時(shí),各組分遷移速度不同而達(dá)到分離的目的。流動(dòng)相一般為pH 6-8的鹽水溶液,具有對(duì)蛋白質(zhì)的回收率高,蛋白質(zhì)變性可能性小等優(yōu)勢(shì)。由于流動(dòng)相中不使用有機(jī)溶劑,也有利于蛋白質(zhì)保持固有的活性。
 
疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術(shù),使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復(fù)雜的生物樣品。目前該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面,成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等,以及一些藥物分子,甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段。
 
疏水色譜柱的影響因素有哪些?
 
1、鹽類和鹽組成
鹽的摩爾表面張力增大,蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應(yīng)增大。各種鹽離子和離子對(duì)具有破壞周圍水分子有序排列的能力。 流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有為重大的影響。選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。
 
2、離子強(qiáng)度
離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強(qiáng)度來增加組分的保留值,降低離子強(qiáng)度來提高組分的解析附能力。
HIC實(shí)驗(yàn)中,改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式,一般宜采用梯度洗脫法,可提高分離的選擇性。
 
3、溶液的酸堿度
溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況,溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),其疏水性增加,有利于與固定相配基相互作用;遠(yuǎn)離其等電點(diǎn),其疏水性減少,不利于與固定相配基結(jié)合,但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。
 
4、柱溫
一般柱溫升高,生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化,疏水作用增加,吸附能力增加,有利于提高層析柱的分離度,所以有時(shí)可以通過提高柱溫來增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用,分離性質(zhì)相近的化合物,如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類,在高溫條件下易變性失活,因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。



    色譜柱是裝填有固定相用以分離樣品組分的柱管,多為金屬或玻璃制作而成;


    主要用于氣相色譜儀液相色譜儀檢測(cè)分析試驗(yàn)中。


    以下簡(jiǎn)單介紹氣相色譜儀試驗(yàn)中常用的金屬色譜柱和玻璃色譜柱的安裝方法及步驟。


    安裝前的準(zhǔn)備:


    請(qǐng)按照氣相色譜柱上面的標(biāo)示確定色譜柱安裝方向,務(wù)請(qǐng)注意!


    金屬柱安裝方法:


    擰緊柱上的螺母,將柱子裝進(jìn)進(jìn)樣器,假定密封墊圈(石墨墊或者四氟乙烯墊)已經(jīng)定位在柱子上;


    若是3mm的柱,只需要用手?jǐn)Q緊再加1/4圈就足夠了;


    若是6mm的柱子,用手?jǐn)Q緊后,再擰3/4圈就足夠了。


    用兩把板子對(duì)起來,一把擰柱子上的螺母,另一把擰襯套,以防止擰柱上螺母時(shí),襯套轉(zhuǎn)動(dòng)。


    玻璃柱安裝方法:(購買前請(qǐng)確定安裝位置及間距尺寸)


    玻璃柱是剛性的,所以必須同時(shí)裝進(jìn)進(jìn)樣器和檢測(cè)器里。


    其安裝程序在柱兩端是相同的。


    玻璃柱可選用密封墊圈,也可選用O型圈來密封:


    石墨襯套適合于大多數(shù)用途,O型圈僅適用低溫操作。


    安裝位置確定:


    進(jìn)樣器末端必須留出足夠的空間,以防插入的針頭接觸玻璃毛堵頭或柱填料(至少留出50-55mm)。


    在氣相色譜儀檢測(cè)器的末端,至少必須留出40mm空間,以防噴嘴的下端碰著填料或玻璃毛堵頭。


    安裝注意事項(xiàng)


    1. 把螺母和密封圈(或O型圈)放在柱子上。


    如果需要的話,在螺母的前面可以外加一只O型圈。


    這樣可以保護(hù)柱子,防止螺母掉進(jìn)柱子的盤管部分。


    2. 把柱插進(jìn)氣相色譜儀進(jìn)樣器和檢測(cè)器,盡可能插到底。


    把柱箱底清掃干凈,可以從柱子的比較長(zhǎng)的那一端開始,以較小的角度開始,將柱插入。


    3. 把柱子拉出大約1~2mm,用手?jǐn)Q緊柱上的兩個(gè)螺母,螺母要擰多少;


    這取決于所用的密封圈的類型。若是O型圈,用手指擰緊就足夠了。







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