液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
液相色譜柱的安裝：
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3／16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7／16英寸外螺紋與1／4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長或其他固定尺寸)。
在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
b、柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 ?m的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 ?m之間。
在日常分析工作中，色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，色譜柱使用是否得當(dāng)，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。
1、柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
2、如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類不多，但分析次數(shù)比較多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
3、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會對柱內(nèi)填料產(chǎn)生沖擊力，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，手動進(jìn)樣時，進(jìn)樣閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
4、應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?/p>
5、使用柱溫箱時，應(yīng)注意在流動相進(jìn)入色譜柱后才能開啟柱溫箱升溫。
6、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
7、選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進(jìn)樣器前面連接一個預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
8、避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
9、經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右。
10、保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿色譜級的乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置一個晚上或更長時間。
11、色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
12、在完成分離分析工作之后，不應(yīng)立即停機(jī)，需及時對色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，一般30分鐘以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
在液相色譜分離系統(tǒng)中，色譜填料選擇的正確與否會直接影響到專業(yè)的液相色譜柱分離物質(zhì)效果的好壞。由于液相色譜填料具有相當(dāng)寬的選擇范圍，所以我們在購買液相色譜柱之前有必要對不同液相色譜填料進(jìn)行一個簡單的認(rèn)識和了解。
第一、正相色譜硅膠基質(zhì)填料。
正相色譜柱的固定相是由硅膠和其他具有極性官能團(tuán)組成的鍵合相填料。其物質(zhì)分離特點(diǎn)是極性較弱組合最先被色譜柱沖洗出來。而且正相色譜所使用的流動相其極性要低于固定相，流動相通常使用正乙烷和二氯甲烷等。
第二、反相色譜硅膠基質(zhì)填料。
反向色譜柱的填料是以硅膠材料為主要物質(zhì)，并與極性相對較弱的官能團(tuán)組成的鍵合相。其物質(zhì)分離特點(diǎn)是極性較強(qiáng)組合最先被色譜柱沖洗出來，而極性弱的組分則會更強(qiáng)的保留在柱子上。反向色譜的流動相的極性相對較強(qiáng)，常配制有機(jī)緩沖液作為流動相。目前較為常用的反相色譜填料有C4（B）、C8（MOS）以及C18（ODS）等。
第三、聚合物填料。
這種聚合物的填料一般是由聚甲基丙酸酯或者聚苯乙烯-二乙烯基苯組成。其特點(diǎn)是這種色譜柱的酸堿度適用范圍相對較廣，且疏水性很強(qiáng)，但它的柱效相對于硅膠基質(zhì)的填料要低一些。一般將這種大孔的基質(zhì)填料用于蛋白質(zhì)的分離。
第四、其他無機(jī)填料。
如石墨化碳對于酸堿度和溫度沒用嚴(yán)格的限制范圍，一般可對一些幾何導(dǎo)構(gòu)體進(jìn)行分離。此外還有氧化鋁以及氧化鋯等無機(jī)填料的應(yīng)用。
總而言之，如果我們能夠全面系統(tǒng)的了解一下液相色譜柱填料的分類及特點(diǎn)，那么我們在選擇購買一流的色譜柱時就可以在一個相對較小的范圍內(nèi)順利找到自己所需要的產(chǎn)品。這樣我們就可以在節(jié)省選擇購買時間的同時，也能快速買到令自己滿意的色譜柱。
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