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前言
目前市面上商品化的反相色譜柱各式各樣，時常讓實驗人員眼花繚亂，產(chǎn)生幸福的煩惱，很難快速選擇合適的色譜柱。通常我們會從鍵合相類型、鍵合相在硅膠表面的覆蓋率、是否封端、封端類型等方面去選擇反相色譜柱。本文從已表征色譜柱的參數(shù)，通過量化數(shù)值去快速選擇合適的反相色譜柱。
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色譜柱表征體系
色譜柱表征體系通過量化分析色譜柱中影響溶質(zhì)保留行為的特征，對色譜柱進行分類，從而指導(dǎo)實際工作中色譜柱的選擇。有效的色譜柱表征體系應(yīng)具有以下特點：
（1）考慮了對色譜柱選擇性有貢獻的所有因素；（2）每一個柱參數(shù)表征一種專屬的溶質(zhì)—色譜柱相互作用；（3）能夠得到da部分商業(yè)柱的色譜柱參數(shù)；（4）對于特定色譜柱，不同實驗室能夠得到 可重現(xiàn)的色譜柱參數(shù)；（5）在特定實驗條件下測定的色譜柱參數(shù)能應(yīng)用到任何流動相或任何柱溫下的分離。
目前國際上比較成熟的色譜柱表征體系有4個，分別是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色譜柱工作小組領(lǐng)導(dǎo)完成。其中，由Snyder等基于反相色譜保留機制提出的疏水消除模型，理論基礎(chǔ)較堅實，對色譜柱選擇性的表征較全面，與其余3個體系的柱參數(shù)本質(zhì)上并無區(qū)別，均取自代表性溶質(zhì)的保留值，參數(shù)測定方法簡便，實現(xiàn)選擇相似或者不同色譜柱的目的。由于USP網(wǎng)站公開常用色譜柱的參數(shù)，USP方法表征的色譜參數(shù)更方便我們篩選色譜柱。
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色譜柱表征參數(shù)
對于反相色譜柱選擇性主要為疏水作用、立體選擇性和氫鍵作用，還有一些二級作用，比如：離子交換、金屬螯合作用等。
3.1 USP數(shù)據(jù)庫
疏水作用（Hy）：通過同yi流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行乙基苯測試，考察乙基苯的保留因子，保留因子越da，色譜柱的疏水作用越強。
立體選擇性（TFA）：通過同yi流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行阿米替林測試，考察阿米替林的拖尾因子，由于阿米替林特殊的立體結(jié)構(gòu)，拖尾因子越小，色譜柱的立體選擇性越強，同時硅醇基作用較弱。
金屬雜質(zhì)含量（CTF）：色譜柱中會殘留少量的金屬離子，一般金屬離子會與喹啉結(jié)構(gòu)發(fā)生螯合作用，導(dǎo)致峰拖尾，故喹啉拖尾因子越da，色譜柱金屬雜質(zhì)含量越da。
氫鍵作用（CFA）：阿米替林是堿性化合物，在酸性或中性條件下呈離子態(tài)，保留因子較小，保留主要依靠氫鍵作用，阿米替林保留因子越da，色譜柱氫鍵作用越強。
3.2 PQRI數(shù)據(jù)庫
疏水作用（H）：通過同yi流流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行戊基苯和丁基苯測試，考察乙戊基苯和丁基苯的保留因子之比，比值越da，色譜柱對不同碳鏈長度化合物的選擇性越強，疏水作用越強。
立體選擇（S）：區(qū)分平面結(jié)構(gòu)（三苯乙烯）和空間體積較da 的結(jié)構(gòu)（鄰三苯基）的能力。前者與后者保留因子之比體現(xiàn)空間選擇性，比值越da，立體選擇越強。圖示見圖1。
氫鍵作用（A或B）：通過同yi流動相體系，在不同的反相色譜柱測試咖fei因和苯酚保留因子比值，數(shù)值越da，氫鍵作用越強。PQRI數(shù)據(jù)庫進一步將氫鍵能力描述為氫鍵酸度(A)、非電離硅烷與堿相互作用的能力和氫鍵堿度(B)、硅膠表面或鍵合相與酸性分析物的特性進一步相互作用的能力。
離子交換作用（pH2.7或7.0）：在流動相pH2.7和7.0下，分別測試苯芐胺和苯酚保留因子之比，比值越da，說明色譜柱區(qū)分極性化合物的能力越強。
固定相類型：A——A型硅膠，無定型硅膠，表面殘余da 量硅醇基；B——B型硅膠，球形高純硅膠，目前主流硅膠類型，硅醇基殘留少；E——鍵合相含嵌入極性基團的固定相；phenyl——聚苯乙烯聚合物固定相；F——氟代固定相。
對比USP與PQRI的數(shù)據(jù)信息，PQRI數(shù)據(jù)庫的色譜柱參數(shù)更加全面反應(yīng)色譜柱的性能。
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案例
目前色譜柱公司均推出各自方法開發(fā)的推薦色譜柱包，比如Waters公司推出經(jīng)濟實惠型的色譜柱包：XBridge C18，XBridge Shield RP18、CORTECS C18+、Xbridge Phenyl和Xselect HSS PFP。通過PQRI數(shù)據(jù)庫檢索。
從上表可知：
①疏水作用CORTECS C18+＞XBridge C18＞XBridge Shield RP18/Xselect HSS PFP＞XBridge Phenyl，XBridge Shield RP18的鍵合相含內(nèi)嵌極性基團，碳載量相對低，苯基柱和五氟苯基柱比C18柱碳載量低，故H值較低。
②空間選擇性，Xselect HSS PFP較為突出，CORTECS C18+低，S值反應(yīng)硅膠表面鍵合相的密度。Xselect HSS PFP柱的空間選擇性強。
③氫鍵作用，XBridge Shield RP18和苯基柱突出，XBridge C18低，XBridge Shield RP18內(nèi)嵌的酰胺基團和苯基與酸性和堿性分析物均有強偶極作用。這兩根柱子可以分離強極性化合物。
④離子交換作用，在酸性和中性條件下五氟苯基柱的離子交換能力突出，對苯環(huán)不同取代物的相似物質(zhì)選擇性強，CORTECS C18+柱在中性條件下離子交換作用強，其對酸性化合物增強保留，對堿性化合物有較好的峰型。
這四款反相色譜柱，各具特點，在分離不同特點的化合物時具有各自的特長，在方法開發(fā)中他們可以互補，可提高柱篩選的效率。
在實際工作中，有好多方法有指定的色譜柱，但我們在研究過程中，會找性能相似的色譜柱作為備選色譜柱?？梢酝ㄟ^PQRI數(shù)據(jù)庫查找與目標(biāo)色譜柱相似的色譜柱，只要F值在3以內(nèi)，均可嘗試。比如方法中規(guī)定選用Nucleodur C18 Gravity，一個小眾品牌的色譜柱，如果想替代之，可從數(shù)據(jù)查詢與之類似的色譜柱。
從上可知：與Nucleodur C18 Gravity相似的色譜柱很多，有我們熟悉的Waters Cortecs C18、島津Inertsil ODS-2和Kromasil C18，并且完全替代Nucleodur C18 Gravity使用的概率很高。
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小結(jié)
反相色譜柱表征體系逐漸成熟，并且廣泛地用于篩選色譜柱。根據(jù)da 多待測物質(zhì)性質(zhì)結(jié)合色譜柱參數(shù)可快速篩選目標(biāo)色譜柱。但色譜柱表征體系針對特定樣品中難分離物質(zhì)對的分離，還有待細化。對于結(jié)構(gòu)類似待測物的分離只和部分關(guān)鍵色譜柱參數(shù)有關(guān)。因此，如何更好地研究難分離物質(zhì)與關(guān)鍵色譜柱參數(shù)的關(guān)系，并針對品種在液相色譜方法中規(guī)定關(guān)鍵柱參數(shù)的zui佳范圍，還需要研究者的不斷探索。
離子色譜柱是離子色譜儀的核心部件之一，樣品中各種離子的分離均在色譜柱中完成，并且一般比常規(guī)液相色譜柱價格要貴很多。因此，對離子色譜柱的維護保養(yǎng)十分重要。
（1）接離子色譜柱前確保系統(tǒng)已清洗干凈。色譜柱在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；很多單位的離子色譜儀是陰、陽離子混用的，因此，接色譜柱前，一定要保證整個離子色譜儀上的所有閥件或管路已清洗干凈，避免造成色譜柱堵塞。
（2）確保色譜柱不進入顆粒物。樣品一定要經(jīng)過預(yù)處理，去除顆粒物等會給泵和色譜柱帶來負擔(dān)的物質(zhì)。
（3）確保離子色譜柱不干燥。每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品，還要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，要參照色譜柱保存辦法，在沖洗干凈后，對陰離子柱要通入一定濃度的堿（對陽離子柱要通入一定濃度的酸），并將色譜柱取下兩端密封保存。
（4）確保色譜柱在一定壓力、流速條件下運行。儀器使用時一定要先檢查整個流動管路中是否有氣泡，如果有，需要先將氣泡排除后再將色譜柱接上，防止將氣泡帶到色譜柱中。因為色譜柱中裝填的樹脂顆粒很小，氣泡進入后將影響樹脂和樣品中離子的交換，同時氣泡也將影響基線的穩(wěn)定性。
色譜柱的柱效能是評價色譜性能的一項重要指標(biāo)，混合物能否在色譜柱中得到分離，除取決于選擇合適的固定相外，還與色譜操作條件及色譜柱的裝填狀況等因素有關(guān)。那么，如何有效地提高色譜柱的柱效呢?
在一定的色譜操作條件下，色譜柱的柱效可用理論塔板數(shù)或理論塔板高度來衡量。一般說來塔板數(shù)愈多，或塔板高度愈小，色譜柱的分離效能愈好。
如何提高HPLC柱效?
要提高液相色譜的效率可從以下幾方面入手。 以下介紹了幾種國際上流行的測量和計算柱效值的方法。
1、提高液相色譜柱柱效的方法
要提高液相色譜的效率可從以下幾方面入手。
(1)降低移動相的流速,但會使分析時間延長。
(2)減少固定相的量,但色譜柱中樣品的負載量也隨之減小。
(3)減小固定相的顆粒度,但不能過分,過分后色譜柱的滲透率也會減小。
(4)選用低粘度的移動相,以利于快速傳質(zhì),但卻不利于多組份分析。
(5)適當(dāng)提高柱溫,可降低移動相的粘度,但柱效和分離度也隨之降低。
(6)盡量減小停滯移動相的體積,但卻加快了移動相的流速。
從以上介紹可看出,在色譜分析過程中,各種因素是互相聯(lián)系和制約的。只有通過對柱效值的跟蹤測算,對自己分析方法不斷的研究和實踐,才能找到zui佳的工作條件。
2、對柱效值進行跟蹤測算應(yīng)注意的問題
我們也應(yīng)記住柱效值并不足以預(yù)測在所有條件下的柱性能，對大多數(shù)色譜工作者來說,柱性能指的是色譜柱用于特定分離的能力,而僅僅有高柱效并不能保證這種分離能力。
不管用什么特定的測試方法,都會有幾個參數(shù)影響柱效的測定。這些參數(shù)包括:洗脫液的成分和粘度及其線流速,測定塔板數(shù)所用的溶質(zhì),溫度,柱長,填料裝填方式,顆粒度,還有所選用的測量和計算方法。而測量和計算方法對柱效值的確定起著極大的作用。
3、幾種測量和計算柱效值的方法
因為色譜峰是假定樣品濃度在移動相和固定相中呈正態(tài)分布而得到的樣品譜帶分布,故常常把色譜峰型看作正態(tài)曲線來計算理論塔板數(shù)。因此計算柱效(以理論塔板數(shù)n為單位)的公式習(xí)慣上定義為:
式中：tR為色譜峰的保留時間;
σ2是以時間為單位測量色譜峰的偏差;
a是和峰高(從測峰寬的基線量起)有關(guān)的常數(shù),
ωb是峰寬,表示由色譜峰頂點與色譜峰兩側(cè)拐點處做切線與峰底基線相交兩點間的距離。
假如一個色譜峰真是正態(tài)峰型,那么每種計算方法都會得到同樣的結(jié)果。然而即使一些比較理想的儀器和傾向于得到對稱峰型的溶質(zhì),由于柱內(nèi)的槽或空隙,也會出現(xiàn)非正態(tài)峰型。所以不同的計算方法將會得到相差較大的n值。通常偏離正態(tài)模型的峰型表示為“前延”或“拖尾”。對于這些峰型,越在峰的高處測量,計算的理論塔板數(shù)值就越大(準(zhǔn)確性越低)。
在許多情況下,色譜工作者需要能反映整個峰型(包括拖尾)的柱效值,同時為了保證定量的重復(fù)性,也需要色譜峰很好的對稱性。這時對色譜峰非對稱性敏感的計算方法適合。如果目的僅僅是要監(jiān)測色譜柱從次使用到使用壽命結(jié)束這一過程中的柱效,那么以上任何一種方法都可以,應(yīng)選擇簡便的方法。
如何提高氣相色譜柱柱效?
在實際工作中，我們通過對載氣流速、進樣技術(shù)、氣化室溫度、色譜柱、柱溫、檢測器溫度這六個方面的選擇，有效地提高了柱效率，使分析出的色譜峰峰形正常，無峰形擴張、拖尾、峰漏檢等不良現(xiàn)象出現(xiàn)，分離度高，從而提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
所為柱效就是在較短的時間內(nèi)，用較短的柱子達到滿意的分析結(jié)果。為了提高色譜柱的柱效率，減少色譜峰擴張、拖尾及峰漏檢等現(xiàn)象，在實際工作中，我們從以下六個方面入手，對柱操作條件的選擇進行了探討。
1、載氣流速的選擇
氣相色譜常用的載氣是：氫氣、氮氣、氬氣、氦氣。
由速率理論可知，載氣流速慢有利于傳質(zhì)，有利于組分的分離，但分析時間會加長;如果載氣流速快有利于加快分析速度，減少分了擴散，但分離度降低。有時為了縮短分析時間，加大流量，但此時分離效果并不好。可見載氣流速的快慢都會降低柱效。
經(jīng)過長時間的實驗，發(fā)現(xiàn)對于一般色譜儀而言，載氣流量為20-100ml/min。目前我們分析液化氣用的是熱導(dǎo)檢測器，載氣用的是氫氣，其流量控制是30 ml/min。分析戊烷發(fā)泡劑用的是氫火焰離子化檢測器，載氣用的是氮氣、燃燒氣氫氣和氧氣，這三種氣體的體積比是氮氣：氫氣：氧氣為1：1：10，分析效果都是較好的。
2、進樣技術(shù)的選擇
在氣相色譜分析中，一般采用注射器或六通閥門進樣。在考慮進樣技術(shù)的時候，以注射器進樣為主來研究。
進樣量：如果在進樣過程中進樣量大會導(dǎo)致：分離度小;保留值變化難于定性;峰高和峰面積與進樣量不成線性關(guān)系，不能定量。進樣量與氣化溫度、柱容量和儀器的線性響應(yīng)范圍等因素有關(guān)。進樣量應(yīng)控制在瞬間氣化，達到規(guī)定分離要求和線性響應(yīng)的允許范圍內(nèi)。填充柱沖洗法的瞬間進樣量:液體樣品或固體樣品溶液一般為0.01～10μl,氣體樣品一般為0.11～10ml,在定量分析中,應(yīng)注意進樣量讀數(shù)準(zhǔn)確。
注射器里空氣的排除：用微量注射器抽取液體樣品,只要重復(fù)地把液體抽入注射器又迅速把其排回樣品瓶,就可以將空氣排除。還有一種更好的方法,那就是用計劃注射量的約2倍的樣品置換注射器3～5次,每次取到樣品后,垂直拿起注射器,針尖朝上，留在注射器里的空氣都應(yīng)當(dāng)跑到針管頂部，推進注射器塞子,空氣就會全部被排掉。
保證進樣量的準(zhǔn)確：用經(jīng)置換過的注射器取約計劃進樣量2倍左右的樣品,垂直拿起注射器,針尖朝上,讓針穿過一層紗布,這樣可用紗布吸收從針尖排出的液體。推進注射器塞子,直到讀出所需要的數(shù)值。用紗布擦干針尖。至此準(zhǔn)確的液體體積已經(jīng)測得,需要再抽若于空氣到注射器里。如果不慎推動柱塞,空氣可以保護液體使之不被排走。
進樣手法：雙手拿注射器。用一只手(通常是左手)扶針插入墊片,注射大體積樣品(即氣體樣品)或柱前壓力極高時,要防止從氣相色譜儀注樣器來的壓力把注射器活塞彈出(即用右手的大拇指按壓住活塞頂部)。讓針尖穿過墊片盡可能深的進入進樣口,壓下注射器活塞停留1秒鐘,然后盡可能快而穩(wěn)地抽出針尖(抽出的同時繼續(xù)壓住注射器活塞)。
進樣時間：進樣時間長短對柱效率影響很大。若進樣時間過長,遇使色譜區(qū)域加寬而降低柱效率。因此,對于沖洗法色譜而言,進樣時間越短越好,一般必須小于1秒鐘。
3、氣化室溫度的選擇
氣化室溫度取決于樣品的化學(xué)和熱穩(wěn)定性、沸程范圍、進樣口類型等。合適的氣化室溫度即能保持樣品瞬間完全氣化，又不引起樣品分解。溫度過低，氣化速度比較慢，使峰形不規(guī)則，出現(xiàn)平頭峰或伸舌峰;溫度過高使出峰數(shù)目變化，產(chǎn)生前延峰，甚至樣品分解。為選擇合適的氣化室溫度，在多次的進樣中我們發(fā)現(xiàn)，氣化室溫度比柱溫高50-100℃或比樣品組分中高沸點高50-70℃較為合適。溫度過高過低都會影響柱效。
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