分光光度計是利用物質對光的選擇性吸收進行物質的定性或定量分析的，在各行各業(yè)得到了廣泛應用，主要用于物質純度檢查、定量分析、物質結構鑒別等?？蓽y量結果總會出現可接受或不可接受的誤差，誤差來源于測量過程的各個方面，我認為主要來源于儀器本身性能和測量條件的選擇兩個方面。
1、儀器本身性能帶來的誤差
1.1復色光對比耳定律的偏離
比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計，也只能獲得近乎單色的光，無法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復色光的性質。而復色光會導致比耳定律的正或負偏離。固定狹縫的紫外分光光度計光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調狹縫的可以做到0.Inm;可見分光光度計帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。光譜帶寬應該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時要綜合考慮各種條件的影響。當溶液濃度較小且單色光較純時，可近似認為符合比耳定律。
1.2雜散光的影響
雜散光是指進人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。產生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴重的測量誤差，實際工作中，在定量分析時，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實吸光度。
1.3儀器噪聲對測t的影響
儀器噪聲也是儀器的一個重要指標，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會掩蓋較小的測量信號，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
1.4波長和吸光度準確度
樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準。吸光度準確度也是用戶對儀器的直接要求，更應引起足夠的重視。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計透射比準確度為A級士0.6%, B級土1.0%。
2、測量條件的選擇
2.1參比溶液和溶荊的選擇
分光光度計的測量實際上是以通過參比池的光強度作為人射光強度來測定試樣的吸光度，先調節(jié)儀器使透過參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過樣品，使得吸光度比較真實地反映待測物質的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測物質與顯色劑的反應產物有吸收，可用純溶劑或蒸餾水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測定波長下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對測定有干擾，而所用顯色劑沒顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。
正確選擇合適的溶劑，對提高分析的準確度起重要作用。為減小溶劑中雜質的影響，應選擇高純度的溶劑;溶劑應不與待測物質發(fā)生化學反應;待測物在溶劑中要有一定的溶解度;在測定的波長范圍內，溶劑本身沒有吸收，注意常用溶劑的最短可用波長;當用揮發(fā)性大的溶劑時，測量過程中吸收池應加蓋。
2.2測試波長的選擇
當用分光光度計對溶液進行測定時，首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長作為測量波長，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長進行測定(曲線較平坦處對應的波長)，以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。
2.3吸光度范圍的選擇
試樣在不同吸光度時，濃度的相對誤差不同，一般選擇A二0.2一0.8之間，濃度相對誤差較小，可以通過改變吸收池厚度、檢測波長或待測溶液濃度，使吸光度讀數在適宜范圍內。
2.4狹縫寬度的選擇
狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值，在定量分析時，為了得到足夠的測量信號，應采用較大狹縫。在定性分析時，為了提高分辨率，應采用較小狹縫，以獲得精細的光譜結構。
2.5吸收池的選擇和使用
吸收池的規(guī)格應根據被測溶液顏色深淺來確定，一般是被測溶液顏色深時選光程短的，顏色淺時選光程長的，同一實驗使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測量之前需要對吸收池作校正和配對工作，吸收池不匹配時，對測量產生誤差，吸收池方向不同，透光率亦有差異，使用時應注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個箭頭，應與光路保持一致。另外，使用時，不要把溶液注得太滿，以防在推動比色皿架時溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再測，否則將產生誤差。
2.6溫度的選定
溫度對溶液顏色的深淺和吸光度都有影響，溫度升高，紫外一可見光譜吸收向短波方向移動。故在繪制標準曲線和測定樣品時，應保持溫度一致，通常在室溫條件下進行。
由于分光光度計引起的測量總誤差除來自自身性能、測量條件外，還來自于分析過程的各個步驟，如試樣處理、分離富集等，可能由于化學操作引起待測組分的損失和雜質的引人。所以出現不可接受的測量誤差時要從多方面分析。
儀器的正確使用和保養(yǎng)也很重要，我們應該做到以下幾點:堅持標準溶液現用現配，不使用過期溶液;比色皿應保持清潔、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面;防止儀器振動，影響測量穩(wěn)定性;在開機狀態(tài)，不測量時，應打開樣品池門，延長壽命;樣品集中測量，避免開機次數，延長光源壽命;一旦停機，則應待燈冷卻后再重新啟動，并預熱15 min左右再使用;要經常更換儀器的干燥劑，防止光學元件和光電傳感器受潮生霉;儀器搬動或更換重要部件后，要重新進行性能確認，以保證測量結果的準確。
分光光度計計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
分光光度計的基本工作原理
分光光度計的基本工作原理是基于物質對光（對光的波長）的吸收具有選擇性，不同的物質都有各自的吸收光帶，所以，當光色散后的光譜通過某一溶液時，其中某些波長的光線就會被溶液吸收。在一定的波長下，溶液中物質的濃度與光能量減弱的程度有一定的比例關系，即符合比爾定律。
T=I/Iolg（Io/I）=εcb
式中，T為透過率，Io為入射光強度，I為透射光強度，A為消光值（吸光度），ε為吸收系數，b為溶液的光徑長度，c為溶液的濃度。從以上公式可以看出，當入射光、吸收系數和溶液厚度一定時，透光率是根據溶液的濃度而變化的。
在使用分光光度計時，我們必須要注意一些使用后的維護，保養(yǎng)，和一些基本使用注意事項，才能達到更好的使用效果。
分光光度計的使用維護：
1、使用的吸收池必須潔凈，并注意配對使用。量瓶、移液吸管均應校正、洗凈后使用。
2、取吸收池時，手指應拿毛玻璃面的兩側，裝盛樣品以池體的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時應加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應無溶劑殘留。吸收池放入樣品室時應注意方向相同。用后用溶劑或水沖洗干凈，晾干防塵保存。
3、供試品溶液濃度除各該品種已有注明外，其吸收度以在0.3～0.7之間為宜。
4、測定時除另有規(guī)定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰±2nm以內，測幾個點的吸收度或由儀器在規(guī)定的波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸收度最大的波長作為測定波長，除另有規(guī)定外吸收度最大波長應在該品種項下規(guī)定的測定波長±2nm以內。
5、供試品應取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應取2份。平行操作，每份結果對平均值的偏差應在±0.5%以內。
6、選用儀器的狹縫寬度應小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度值會偏低，狹縫寬度的選擇應以減少狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準，對于大部分被測品種，可以使用2nm縫寬。
7、單色器是儀器的核心部分,裝在密封盒內不能拆開,為防止色散元件受潮發(fā)霉,必須經常更換單色器盒干燥劑。
8、光電轉換元件不能長時間曝光,應避免強光照射或受潮積塵。
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