液相色譜使用較多的是紫外檢測器，為了使一些沒有紫外吸收或紫外吸收很弱的化合物能被紫外檢測器檢測，往往通過衍生化反應(yīng)在這些化合物的分子中引入有強紫外吸收的基團：2,4-二硝基苯、苯甲基、對硝基苯甲基、3,5-二硝基苯甲基、苯甲酸酯、對甲苯酰、對氯苯甲酸制、對硝基苯甲酸酯、對甲氧基苯甲酸酯、苯甲酰甲基、對溴苯甲酰甲基，這些衍生物可被紫外檢測器檢測。
大多數(shù)紫外衍生反應(yīng)來自經(jīng)典的光度分析和有機定量分析，新的衍生化反應(yīng)和衍生化試劑是隨液相發(fā)展而發(fā)展的，這些反應(yīng)的原理都來自有機合成，所以就要求操作者對有機合成有所了解。但是，由于柱前衍生化是為色譜分析準備樣品，處理樣品的量?。╩g級），所用的小型和微型反應(yīng)器皿又不同于常量的有機合成，而是類似于近年來發(fā)展的微量有機合成。紫外衍生化反應(yīng)要選擇反應(yīng)產(chǎn)率高、重復性好的反應(yīng)。過量試劑和試劑中的雜質(zhì)如果干擾下一步的色譜分離和檢測，則在色譜進樣前要進行純化分離。還要注意反應(yīng)介質(zhì)對紫外吸收的影響。
?。?）苯甲酰化反應(yīng)：苯甲酰氯及其衍生物--對硝基苯甲酰氯、3,5-二甲基苯甲酰氯和對甲氧基苯甲酰氯都可以同胺、醇和酚類化合物反應(yīng)，生成紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物；
?。?）2,4-二硝基氟代苯（DNFB）的反應(yīng)：DNFB與醇的反應(yīng)產(chǎn)率很低，但可與大多數(shù)伯胺、仲胺和氨基酸反應(yīng)，生成強紫外吸收的苯胺類衍生物；
?。?）苯基異硫氰酸酯（PITC）的反應(yīng)：PITC可與氨基酸反應(yīng)，生成苯基己丙酰硫脲衍生物--PTH氨基酸；
?。?）苯基磺酰氯的反應(yīng)：苯基磺酰氯可與伯胺和仲胺反應(yīng)。
甲苯磺酰氯可與多氨基化合物反應(yīng)，不僅能提高它們的檢測靈敏度，還可改變HPLC的分離度。
?。?）有機酸的酯化反應(yīng)：有機酸很容易與酰溴基反應(yīng)生成酯，常用的酰溴基試劑有苯甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、對溴基苯甲酰溴和對硝基苯甲酰溴等；
酯化反應(yīng)在極性溶劑（如乙腈、丙酮或四氫呋喃）中進行，有時需要加催化劑，如冠醚加鉀離子、二乙胺或N-二異丙基胺等。
?。?）羰羥基化合物的反應(yīng)：醛類和酮類中的羰基可與2,4-二硝基苯肼（DNPA）反應(yīng)，反應(yīng)在弱酸性條件下進行，生成苯腙衍生物。
羰基化合物還可以與對甲基芐基羥胺（PNBA）在堿催化下反應(yīng)，生成有強紫外吸收的肟。
液相色譜儀的應(yīng)用，可用于高沸點、熱穩(wěn)定性差以及具有生理活性物質(zhì)的分析。一般來說，沸點在450℃以下，相對分子質(zhì)量小于450的有機物可用液相色譜儀分析，但這些物質(zhì)只占有機物的15%～20%，其余的80%～85%有機物原則上都可采用高效液相色譜儀分析。
色譜柱的使用和維護，色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。調(diào)節(jié)流速太快，避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
反沖色譜柱，一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效，預柱和保護柱，選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。
有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)，由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。
工作原理，利用混合物各組分在固定相和流動相中溶解、分配或吸附等化學作用性能的差異，使各組分在作相對運動的兩相中反復多次受到上述各作用力而達到相互分離。
從液相色譜儀工作流程中看到，色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。
色譜填料：經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。
色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長250mm。
色譜柱：也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的，色譜柱的填充，干法填充：在硬臺面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺面墩10-20次。
濕法填充：又稱淤漿填充法，使用專門的填充裝置。
液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜及液-固色譜。現(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點。
1、 泵。
泵是液相色譜儀的心臟。處于良好工作狀態(tài)的泵，基線平穩(wěn)，保留時間重現(xiàn)性好，梯度洗脫時壓力變化緩慢而且平穩(wěn)。
1)選擇優(yōu)質(zhì)的溶劑和試劑，在進入儀器前用 0.45um 膜過濾，并進行脫氣處理。
2)泵開始使用時，一定要用合適的流動相徹底清洗干凈。
3)定期檢查并更換在線過濾片及有關(guān)的墊圈，經(jīng)常清洗進液處的微孔濾頭。
4)改變流動相時，應(yīng)注意沉淀的產(chǎn)生，以防止泵堵塞。
2、色譜柱。
色譜柱是化合物分離的關(guān)鍵。保養(yǎng)良好的色譜柱具有很高的塔板數(shù)，基線平穩(wěn)。
1)色譜柱比較嬌氣不能夠碰撞、彎曲或強烈震蕩;安裝時要保證閥件或管路的清潔。
2)流動相在使用前必須進行脫氣處理，盡量不使用或少使用高粘度的流動相。
3)在滿足靈敏度的前提下，盡可能的使用小進樣量。如果樣品比較臟，要進行凈化或提純處理。
4)分析結(jié)束后要清洗掉進樣閥中殘留的樣品，并用流動相或適當?shù)娜軇┣逑瓷V柱。
5)如長期不用，用適當?shù)挠袡C溶劑保存并封閉或定期補充合適的流動相。
3 、檢測器
分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。
4 、進樣器
分析結(jié)束后反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染或堵塞。
上一篇：五種常見多參數(shù)水質(zhì)檢測儀的檢測...
下一篇：恒溫水浴的操作使用及注意事項
449717568
