1. 原理食物中的膽堿經(jīng)過處理提取后，通過Florisil柱色譜純化，然后用雷納克鹽（Reineckate）與膽堿反應(yīng)形成粉紅色的膽堿－雷納克鹽復(fù)合物，這種復(fù)合物被丙酮洗脫后，在526nm有最大吸收，其吸收值與膽堿濃度成正比。

2. 適用范圍參照Methods of Vitamin Assay，適用于各類食物中膽堿的測(cè)定。

3. 儀器與設(shè)備（1）實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。（2）回流提取裝置。（3）色譜柱：為0.8cm（內(nèi)徑）×30cm的玻璃柱，柱上端為體積30～50mL的貯液池，底端收縮變細(xì)，并裝有活塞。活塞上約1cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm。（4）分光光度計(jì)。

4. 試劑除特殊說明外，所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。（1）甲醇。（2）氯仿。（3）乙酸甲酯。（4）丙酮：用前重蒸餾。（5）10％丙酮：取50mL丙酮溶解于450mL水中。（6）冰乙酸。（7）冰乙酸－甲醇溶液：取50mL冰乙酸和40mL甲醇混合。（8）飽和氫氧化鋇提取液：于1000mL甲醇中加入40g無水Ba（OH）2，攪拌10min，再加入100mL氯仿，混合，使Ba（OH）2飽和，過濾去除多余的Ba（OH）2。（9）硅鎂吸附劑（Florisil）：Sigma公司，60～100目。（10）雷納克銨（Ammonium Reineckate）飽和溶液：稱取2～3g雷納克銨，加入100mL水中，攪拌10min，過濾去除多余的雷納克銨。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日配制。（11）膽堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5g/L）：準(zhǔn)確稱取無水氯化膽堿0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。（12）膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作液（1g/L）：準(zhǔn)確吸取2.0mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用水稀釋定容至100mL。

5. 測(cè)定步驟所有操作均需避光進(jìn)行。（1）提取：稱取適量樣品（約含5～50mg膽堿），置于100mL具塞錐型瓶中，加入30mL提取液，邊加邊搖，避免結(jié)塊。然后放置于76～80℃恒溫水浴回流2～4h，回流速度為1～2滴/s[注意：加熱回流的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在80℃左右，否則樣品易撲濺，造成損失。樣品提取率與回流時(shí)間有關(guān)，回流2h，提取率達(dá)到最高值，回流3～4h，可以保證樣品提取較完全]。冷卻，樣品過濾至100mL容量瓶中，反復(fù)用5～10mL冰乙酸－甲醇溶液洗滌錐形瓶和濾渣，濾液并入容量瓶中。用pH試紙測(cè)定提取液pH在2～6范圍之內(nèi)[注意：必要的話可加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH]，然后用甲醇定容至刻度。（2）純化：
① 填裝色譜柱：將硅鎂吸附劑浸入甲醇中，濕法將硅鎂吸附劑填充入色譜柱中[注意：色譜柱可以經(jīng)過干燥處理，否則影響洗脫液流速]，至硅鎂吸附劑的高度達(dá)10cm（約4g）。用甲醇沖洗色譜柱，并保持甲醇高于硅鎂吸附劑頂端0.5～1cm。
② 色譜柱純化：吸取一定量的提取液回到色譜柱中，打開底端活塞，使提取液靠重力作用通過色譜柱。先后用5、10mL甲醇洗滌色譜柱。待甲醇通過色譜柱后，依次用2份10mL乙醇甲酯，10mL冷的10％丙酮洗滌色譜柱。接著加入5mL雷納克銨飽和溶液[注意：雷納克銨與吸附于色譜柱上的膽堿結(jié)合]，待雷納克銨飽和溶液完全通過色譜柱后，用2份10mL冰乙酸洗滌直至流出液清亮炎止[注意：冰乙酸的作用是洗脫未與膽堿結(jié)合的過量的雷納克銨，應(yīng)注意洗脫安全]。用15mL丙酮洗脫色譜柱上膽堿－雷納克鹽復(fù)合物的粉紅色色譜帶，收集洗脫液，并用丙酮定容至15mL。（3）比色測(cè)定：用1cm比色杯，以丙酮調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于526nm波長(zhǎng)下，測(cè)定樣品吸光度，其值在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出，或通過回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的膽堿含量，供計(jì)算使用。（4）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：分別吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，加至色譜柱上，按照上述樣品測(cè)定步驟操作。以膽堿含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

6. 結(jié)果計(jì)算
式中 x——樣品中膽堿的含量，mg/100g；
m1——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線或回歸方和中查到的膽堿含量，mg；
V1——樣品提取液的總體積，mL；
V2——純化用提取液的體積，mL；
m——樣品質(zhì)量，g。

7. 結(jié)果的允許差同一實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差絕對(duì)值＜10％。

8. 注意事項(xiàng)（1）硅鎂吸附劑填充的高度關(guān)系到洗脫液的用量，如果填充過高，則應(yīng)加大洗脫液用量，以保證膽堿的純化和完全洗脫。（2）純化過程中冰乙酸的作用是將不能與膽堿形成復(fù)合物的多余雷納克銨鹽洗脫，丙酮?jiǎng)t是洗脫膽堿－雷納克銨復(fù)合物，如果這兩步洗脫不完全，均影響膽堿的測(cè)定，所以必要時(shí)應(yīng)增加冰乙酸和丙酮的用量以保證測(cè)定結(jié)果。