一，分光光度計的用途：
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值可以在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質的直接定量（UV法）
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，較佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩(wěn)定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質濃度。
比色方法
一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以比較早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，可以是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，可以是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
細菌細胞密度（OD 600）
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內測試樣品。
由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發(fā)展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關實驗室的必備設備之一。
隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)在比色杯已經(jīng)不是使用分光光度計時的必備物品。目前國外Nanodrop公司（現(xiàn)已被Thermo Fisher公司收購）生產的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經(jīng)可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。
原子吸收分光光度計與普通的紫外可見分光光度計的結構節(jié)本相同，只是光源用空心陰極燈光源代理連續(xù)光源，用原子化器代替了吸收池，所以原子吸收分光光度計主要由：光源，原子化器，單色器以及檢測系統(tǒng)和記錄顯示系統(tǒng)幾部分組成（如下圖）。
1.光源 光源的功能是發(fā)射被測元素基態(tài)原子所吸收的特征共振輻射。對光源的基本要求是:發(fā)射輻射的波長半寬度要明顯小于吸收線的半寬度、輻射強度足夠大、穩(wěn)定性好、使用壽命長。 (1)空心陰極燈 空心陰極燈的結構如下圖所示。
空心陰極燈有一個由被測元素材料制成的空腔形陰極和一個鎢制陽極。陰極內徑約為2mm，放電集中在較小的空間內，可得到高輻射強度。陰極和陽極密封在帶有光學窗口的玻璃管內，內充惰性氣休，根據(jù)所需透過輻射波長，光學窗口在370nm以下用石英，370nm以上用普通光學玻璃。 空心陰極燈是一種特殊輝光放電裝置，放電主要集中在陰極腔內，當在兩極上加上200~500V電壓時，陰極發(fā)出的電子在電場作用下被加速，在飛向陽極的過程中，與載氣的原子碰撞并使之電離。荷正電的載氣離子又從電位差獲得動能，轟擊陰極表面，將陰極材料的原子從晶格中濺射出來。濺射出來的原子再與電子、原子、離子等碰撞而被激發(fā)，發(fā)出被測元素特征的共振線。在這個過程中，同時還有載氣的譜線產生。燈內填充氣壓較低，一般為399.9~798.9Pa，陰極濺射的金屬蒸氣密度相對于大氣壓下氣體放電而言，也是很低的，因此，譜線的碰撞變寬被限制到了很小程度。燈的工作電流較小，一般為幾毫安至20mA，因此陰極溫度和氣休放電溫度都不很高，譜線的多普勒變寬可控制得很小。所以空心陰極燈是一種實用的銳線光源;缺點是測一種元素換一個燈，使用非常不方便。 (2)多元素空心陰極燈多元素燈就是在陰極內含有兩種或兩種以上不同元素，點燃時，陰極負輝區(qū)能同時輻射出兩種或多種元素的共振線，只要更換波長，就能在一個燈上同時進行幾種元素的測定。缺點是輻射強度、靈敏度、壽命都不如單元素燈，組合越多，光譜特性越差，譜線干擾也大。 2.原子化器 原子化器的功能是將試樣轉化為所需的基態(tài)原子。被測元素由試樣溶液中轉入氣相，并解離為基態(tài)原子的過程，稱為原子化過程。 實現(xiàn)原子化的方法有兩種:火焰原子化法和無火焰原子化法。 (1)火焰原子化法實現(xiàn)火焰原子化的原子化器有兩種，即全消耗型和預混合型。全消耗型原子化器系將試液直接噴人火焰;預混合型原子化器泡括霧化器、霧化室和燃燒器三部分，霧化器將試液霧化并使霧滴均勻化，然后冉噴人火焰中。一般儀器多采用預混合型。
霧化器的作用是使試液霧化。目前普遍采用同心形霧化器，目前普遍采用同心型霧化器，多用特種不銹鋼或聚四氟乙烯塑料制成，其中的毛細管多用貴金屬的合金制成，能耐腐蝕。當高壓載氣(助燃氣)以高速通過時，在毛細管外壁與噴嘴口構成的環(huán)形間隙中形成負壓區(qū)，從而將試液沿毛細管吸入，并被高速氣流分散成霧滴，經(jīng)節(jié)流管碰在撞擊球上，進一步被分散成細霧。末被細微化的霧滴在霧化室內凝結為液珠，沿排泄管排出;細霧則在室內與燃氣充分混合并進入燃燒器。燃燒器的功用是形成火焰，使進入火焰的微粒原子化，常用的燃燒器是單縫型噴燈，縫長有5cm和10cm兩種。預混合型原子化器的優(yōu)點是，進人火焰的微粒均勻且細微，在火焰中可瞬吋原子化，形成的火焰穩(wěn)定性好，有效吸收光程長;缺點是試樣利用效率較低，一般約為10%，試液濃度高時，試樣在霧化室壁宥沉積，產生“記憶”效應。 試樣霧滴在火焰中，經(jīng)蒸發(fā)、干燥、離解(還原)等過程產生大量基態(tài)原子?；鹧嫒紵乃俣扔绊懟鹧娣€(wěn)定性和操作安全，而火焰溫度會影響化合物的蒸發(fā)和分解?；鹧鏈囟仍礁撸a生的熱激發(fā)態(tài)原子越多，但同時也可能會產生干擾。因此，在保證待測元素充分離解為基態(tài)原子的前提下，盡量采用低溫火焰。 火焰溫度取決于燃氣與助燃氣類型，根據(jù)燃氣與助燃氣的比例可分為三種類型: ①化學計量火焰(中性火焰），溫度高，干擾少，火焰穩(wěn)定，背景低，實驗中常用; ②貧燃火焰(氧化性火焰），助燃氣多，火焰溫度低，氧化性氣M，適用于堿金屬測定; ③復燃火焰(還原性火焰），燃氣多，燃燒不完全，適合測定較易形成難熔氧化物的元素(Mo、Cr、稀土等)的測定。 空氣-乙炔火焰較為常用，最高溫度為2600K，能測35種元素。乙炔-氧化亞氮火焰也較為常用。不同火焰的溫度如表所示。
(2)無火焰原子化法 在無火焰原子化法中，有石墨爐法、冷蒸氣發(fā)生原子化法及氫化物發(fā)生原子化法等。應用廣泛的原子化器是管式石墨爐原子化器。本質上它是一個電加熱器，由電熱石墨爐及電源等部件組成。其功能是利用電能加熱盛放試樣的石墨容器，使之達到高溫，將供試品溶液干燥、灰化，再通過高溫原子化階段使待測元素形成基態(tài)原子。石墨爐是外徑為6mm、內徑為4mm、長度為53mm的石墨管，管兩端用銅電極夾住。樣品用微量注射器直接由進樣孔注入石墨管中，通過銅電極向石墨管供電。石墨管作為電阻發(fā)熱休，通電后可達到2000~3000°C高溫，以蒸發(fā)試樣和使試樣原子化。銅電極周圍用水箱冷卻。蓋板蓋上后，構成保護室，室內通以惰性氣休氬氣或氮氣，以保護原子化了的原子不再被氧化，同時也可延長石墨管的使用壽命。 原子化過程分為干燥、灰化(去除基休)、原子化、凈化(去除殘渣）四個階段，待測元素在高溫下生成基態(tài)原子。 與火焰原子化法相比，石墨爐原子化的特點是，原子化在充有惰性保護氣的氣室內，有利于還原性石墨介質中進行，有利于難熔氧化物的分解;取樣量小，通常同休樣品為0.1~10mg，液休樣品為1~50μl，試樣全部蒸發(fā)，原子在測定區(qū)的有效停留時間長，幾乎全部樣品參與光吸收，絕對靈敏度高;排除了化學火焰中常常產生的被測組分與火焰組分之間的相互作用，減小了化學干擾;固體試樣與液休試樣均可直接應用。由于取樣量小，試樣組成的不均勻性影響較大，測定精度不如火焰原子化法好;有強的背景;設備比較復雜，費用較高。 氫化物發(fā)生原子化器由氫化物發(fā)生器和原子吸收池組成，可用于砷、硒、錫、銻等元素的測定，其功能是將待測元素在酸性介質中還原成低沸點、易受熱分解的氫化物，再由載氣導入由石英管、加熱器等組成的原子吸收池，在吸收池中氫化物被加熱分解，并形成基態(tài)原子。 冷蒸氣發(fā)生原子化器由萊蒸氣發(fā)生器和原子吸收池組成，專門用于汞的測定。其功能是將供試品溶液中的汞離子還原成汞蒸氣，再由載氣導入石英原子吸收池進行測定。 非火焰原子化法的優(yōu)點是靈敏度高，取樣量少，甚至可不經(jīng)過前處理直接進行分析。但基體的影響比火焰法大，測定的精密度(5%?10% )比火焰法(1% )差。 3.單色器 單色器的作用是將所需的共振吸收線分離出來，由于原子吸收分光光度計采用銳線光源，吸收值測量采用瓦爾什提出的峰值吸收系數(shù)測定方法，吸收光譜本身也比較簡單，因此對單色器分辨率的要求不是很高。單色器中的關鍵部件是色散元件，現(xiàn)多用光柵。為了阻止來自原子吸收池的所有輻射不加選擇地都進入檢測器，單色器通常配置在原子化器以后的光路中。 4.檢測系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)主要由檢測器、放大器、對數(shù)變換器、指示儀表所組成。檢測器多為光電倍增 管和穩(wěn)定度達0.01%的負高壓電源組成，工作波段大多在190~900nm之間。
分光光度計的使用步驟主要有哪些?下面本生(天津)健康科技有限公司工程師做如下紹：
一、把分光光度計電源線連接好，儀器的電源具備接地功能;
二、接通電源后，按動開機開關，然后讓儀器預熱至少20分鐘，儀器會自動校正，然后顯示546.0nm 0.000A說明自檢結束，就可以開始測試;
三、使用“方式”鍵測試的方式，再根據(jù)自己要測量的結果選透光率、吸光度、和濃度的測試;
四、要對波長進行分析，選擇按鍵6，然后按提示依次進行;
五、把樣品溶液和要測定的溶液各自倒入比色皿中后，然后打開樣品蓋，把盛著溶液的比色皿插入另一個比色皿中，后蓋好樣品蓋;
六、把參比的溶液拉到光路中按住“OABS/100%T”鍵，這時的顯示器會顯示出BLANKING,，直到后顯示出“100%T”或者是“0.000A”為止;
七、后儀器顯示出“100%T”或者是“0.000A”即可結束測試。這時被測樣品的透光度、吸光度等參數(shù)就可直接讀出;
八、分光光度計使用完畢，關上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。
分光光度計的使用注意事項：
1、分光光度計應放在干燥的房間內，使用時放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，室內照明不宜太強。熱天時不能用電扇直接向儀器吹風，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定;
2、分光光度計使用前，使用者應該首先了解分光光度計的結構和工作原理，以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應該對儀器的安全性能進行檢查，電源接線應牢固，通電也要良好，各個調節(jié)旋鈕的起始位置應該正確，然后再按通電源開關;
3、在分光光度計尚未接通電源時，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進行調節(jié)。
注：分光光度計的使用方法步驟暫時有以上幾點，如有疑問，請及時咨詢本生科技分光光度計工程師!
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