液相色譜關(guān)于多數(shù)人來說都是很好上手的儀器了，但是就算是用過幾年、經(jīng)歷豐厚的剖析員都會習(xí)氣于一些錯誤的操作，經(jīng)常招致一些儀器毛病。便當快捷的剖析過程固然重要，但是為了多做樣品而疏忽了一些必不可少的步驟，常常得失相當，哪些操作不能做？哪些懶兒不能偷？那些小概率的毛病師傅沒教怎樣辦？液相運用過程中有哪四大關(guān)鍵要素要留意？

活動相不過濾

由于塵埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因而應(yīng)預(yù)先除去活動相中的任何固體微粒?；顒酉嗫梢栽诓Ａ萜鲀?nèi)蒸餾，而常用的辦法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應(yīng)銜接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或改換。

運用后沒有及時清洗泵

活動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的活動相不應(yīng)保存在泵內(nèi)，特別是在停泵過夜或更長時間的狀況下。假如將含緩沖液的活動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或走漏，以至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。

因而，必需泵入純水將泵充沛清洗后，再換成合適于色譜柱保管和有利于泵維護的溶劑（關(guān)于反相鍵合硅膠固定相，能夠是甲醇或甲醇-水）。

活動相走空

泵工作時要留心避免溶劑瓶內(nèi)的活動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。

沒有活動相流出，又無壓力指示怎樣辦？

可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可翻開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處協(xié)助抽出氣體。另一個可能緣由是密封環(huán)磨損，需改換。

壓力和流量不穩(wěn)了？

緣由可能是氣泡，需求掃除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細晶?；蜃躺奈⑸锞植抗Ｈ?，這時，可卸下砂濾棒浸入活動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)疾速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立刻清洗。

壓力為啥過高或過低？

可能是是管路被梗塞，需求肅清和清洗。壓力降低的緣由則可能是管路有走漏。檢查梗塞或走漏時應(yīng)逐段停止。

在停止梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不時變化，因而帶來一些特殊問題，必需充沛注重：

PS：（在液相色譜中對組分復(fù)雜的樣品采用梯度洗脫的辦法。在同一個剖析周期中，按一定程序不時改動活動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而能夠使一個復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差別較大的組分能按各自適合的容量因子k到達良好的別離目的。

梯度洗脫的優(yōu)點：1.縮短剖析周期；2.進步別離才能；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加靈活度。但有時惹起基線漂移。）

梯度洗脫的活動相選擇不當

要留意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的活動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，運用時更要惹起留意。

當有機溶劑弛緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，特別運用磷酸鹽時需特別當心。

疏忽的空白梯度洗脫

梯度洗脫所用的溶劑純度請求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。停止樣品剖析前必需停止空白梯度洗脫，以識別溶劑雜質(zhì)峰，由于弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。

用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以避免混合時產(chǎn)生氣泡。

疏忽了溶劑混合所帶來的粘度變化

混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫經(jīng)常呈現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為活動相時的兩倍。因而要留意避免梯度洗脫過程中壓力超越輸液泵或色譜柱能接受的最大壓力。

關(guān)于六通閥的正確運用和維護

①樣品溶液進樣前必需用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。

②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則活動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，以至超越泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。

③為避免緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次剖析完畢后應(yīng)沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

關(guān)于色譜柱的運用和維護

色譜柱的正確運用和維護非常重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短運用壽命以至損壞。在色譜操作過程中，需求留意下列問題，以維護色譜柱。

調(diào)理流速太快。。。

防止壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的忽然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充情況；柱壓的忽然升高或降低也會激動柱內(nèi)填料，因而在調(diào)理流速時應(yīng)該遲緩?fù)Ｖ梗陂y進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）。

反沖色譜柱。。。

普通說來色譜柱不能反沖，只要消費者指明該柱能夠反沖時，才能夠反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會疾速降低柱效。

預(yù)柱和維護柱

選擇運用適合的活動相（特別是pH），以防止固定相被毀壞。有時能夠在進樣器前面銜接一預(yù)柱，剖析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使活動相在進入剖析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，防止剖析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

防止將基質(zhì)復(fù)雜的樣品特別是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需求對樣品停止預(yù)處置或者在進樣器和色譜柱之間銜接一維護柱。維護柱普通是填有類似固定相的短柱。維護柱能夠而且應(yīng)該經(jīng)常改換。

液相色譜在運用過程中主要有四大關(guān)鍵要素

1.液相色譜儀自身：

關(guān)于儀器自身普通不會有問題，特別是剛買回來的新儀器。關(guān)于儀器自身較為重要的就是儀器的校驗，剛買回來的儀器普通都是由賣家先對儀器做系統(tǒng)確實認工作（包括IQ、PQ、OQ），確認順利經(jīng)過后，再請國度或省級儀器檢定局的來校驗，檢定合格后就能夠放心運用了，除此之外，一些做得好的公司每半年會對儀器停止一次的內(nèi)部校驗，目的就是為了保證儀器的正?？蛇\轉(zhuǎn)狀態(tài)。

2.色譜條件：

色譜條件普通包括活動相、色譜柱、檢測波長、流速及進樣量。

活動相就觸及到配制活動相所用到的水和試劑試液，水普通請求用超純水或其他水的電阻率不大于18.2兆歐級別，試劑試液請求用色譜級別的，緣由為避免水和試劑試液中的雜質(zhì)對色譜結(jié)果的干擾。

色譜柱會因不同的種類而有不同的請求，但每根色譜柱都有它的清洗請求，這個在色譜柱闡明書上都能夠找到，一定要依據(jù)上面的請求停止，否則會形成色譜柱效降落和色譜柱的運用壽命縮短，檢測波長也會因種類的不同有不同的請求，這里需求指出的是要留意察看檢測器氘燈能量的變化，比方基線動搖大，活性成分的響應(yīng)值忽然變小等，都有可能是氘燈的能量缺乏所惹起的，氘燈普通倡議運用800小時，但實踐上運用時間不止，可依據(jù)實踐狀況改換。

流速也因種類的不同而不同，普通為1.0ml/min，流速是不可隨意改動的，特別是作為QC人員，但是作為研發(fā)人員，有時為了探索條件或停止辦法耐用性考證，會對流速停止改動以評價辦法的適用性。關(guān)于進樣量因不同的種類也有不同規(guī)則，進樣量這塊如今都運用自動進樣，所以進樣精細度都很好，不需強調(diào)什么。

3.操作人員：

首先，作為液相操作人員，一定要認真學(xué)習(xí)夜想的闡明書，控制液相硬件和軟件的操作，控制日常的維護頤養(yǎng)，控制最根底毛病的掃除和維修。

普通液相的操作規(guī)程也是有操作人員起草的，所以只需嚴厲依照操作請求停止操作，普通不會呈現(xiàn)問題，當然啫喱需求特別指出的是關(guān)于液相的日常維護頤養(yǎng)很重要，比方活動相的過濾、脫氣、泵密封墊的清洗、系統(tǒng)管路的清洗、溶劑過濾頭的清洗等，假使不堅持，很容易招致色譜柱梗塞、系統(tǒng)壓力過大、色譜峰異常等不用要的毛病，糜費時間。

其次，操作人員在配制液相剖析用樣品溶液時，可以由同一個人單獨完成，以免不用要的偶爾誤差。

4.液相裝置環(huán)境：

液相色譜儀應(yīng)盡量裝置于程度、遠離振動、電磁干擾的屋內(nèi)的臺面上，有條件的話盡量將液相數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)分隔開，一個是避免色譜基線噪音偏大，基線不穩(wěn)等，一個是為減少對人體的危害。

各位小伙伴在實驗分析中應(yīng)該都遇到過這類問題，在液相色譜中，對于組分復(fù)雜的樣品，采用一種色譜體系，往往很難得到理想的分離效果，要么分離時間太長，要么分離度太差。這種情況，采用梯度洗脫就可以縮短分析時間，提高分離效果。下面和大家分享一則梯度微調(diào)實例，一起感受下梯度微調(diào)對分離效果的奇妙影響吧。

1、盡量在能長時間測試該項目的儀器上開發(fā)方法；

2、需要了解系統(tǒng)的性能，避免出現(xiàn)儀器系統(tǒng)改變后不能重現(xiàn)的問題；

3、要知道系統(tǒng)的兩個基本情況：梯度滯后體積和比例精確性。這可以在同一個實驗里得到這兩個數(shù)據(jù)：參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規(guī)程》中《梯度誤差》實驗：在B溶液（0.1%丙酮）后加紫外檢測器，設(shè)置一個多階層的梯度，B溶液以5%的幅度從0%變到100%，流速與平常一樣，流速為1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通運行梯度，記錄圖譜。每段梯度設(shè)置的時間與實際發(fā)生的梯度時間之差就是梯度延遲時間，階層的高度可以用來測量流動相比例，這些階層可能有點模糊，是由系統(tǒng)中混合體積造成的；

4、檢測完系統(tǒng)，就可以按照它的性能來設(shè)計方法。梯度方法轉(zhuǎn)換最大的問題是梯度滯后體積，如果知道儀器的滯后體積比最初開發(fā)方法的儀器大，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差別，如果目標系統(tǒng)滯后體積小，就要在轉(zhuǎn)移方法的時候在方法開始加一段梯度延遲時間，如果比例差別是在梯度運行中間出現(xiàn)的，也可以通過調(diào)節(jié)梯度圖譜來抵消這種差別，但是一般很少遇到過需要這么做的情況。

5、初始流動相沒有充分平衡。柱子已經(jīng)用初始流動相平衡了，但在分析中，梯度變化很快，而柱子沒有用初始流動相充分平衡好，這樣di一針時總是與后面的不一樣。但是如果轉(zhuǎn)移到有不一樣滯后體積的系統(tǒng)時，可能就是另一種情況。

項目背景

名稱：12種酚類

色譜柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流動相A：水   流動相B：乙腈

問題：柱子正?；罨M樣，基線和整體出峰均不理想，分離度較差。

1.柱子在運輸或儲存過程中保存液發(fā)生變化，導(dǎo)致填料產(chǎn)生微小改變，碳鏈蜷縮，未舒展開來，對目標物的保留造成影響；

2.儀器系統(tǒng)存在梯度滯后，在梯度變化過程中，兩相混合不精準，導(dǎo)致的物質(zhì)分離問題；

3.目標物受溶劑效應(yīng)影響；

4.梯度變化過快，流動相的洗脫能力太強，導(dǎo)致色譜峰未達到分離效果。

1.測試梯度滯后體積和比例精確性；

2.用初始流動相0.2流速過夜平衡柱子；

3.樣品用初始流動相溶解（慎用，改變樣品溶劑后需要驗證樣品溶液的穩(wěn)定性）；

4.調(diào)節(jié)梯度，減緩洗脫速率，減小洗脫能力；

基線和峰形大有改善，但是最后一個峰在梯度時間外出峰了。

梯度變化中，水相速率增長較快，物質(zhì)保留變強，沒有獲得足夠的洗脫能力，最后一個物質(zhì)出峰較晚。

前段分離好的梯度不做調(diào)整，調(diào)整最后一個物質(zhì)出峰梯度階段的有機相比例，增加洗脫能力。

以上說明，項目的成功與否，不僅取決于色譜柱類型，儀器條件，還有方法的建立。其中流動相便是考察重點，流動相梯度洗脫必要時可以充分應(yīng)用上，他是由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中不同時間段各溶劑組成的比例改變流動相極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品的所有組分在最短時間內(nèi)實現(xiàn)佳分離。好啦，今天的分享就先到這，希望能對小伙伴們有所啟發(fā)有所幫助哦。