微生物數(shù)量的測定——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法！
細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidityestimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA 和DNA 的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等?？傊瑴y定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。
一、目的要求
1、明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。
2、掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。
二、基本原理
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser 計(jì)菌器以及Hawksley 計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點(diǎn)是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。
本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25 個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16 個(gè)小方格(圖15-2)；另一種是一個(gè)大方格分成16 個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25 個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400 個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（一） 圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（二）A. 正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；2. 蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25 或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml 菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25 個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1mL 菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個(gè)）同理，如果是16 個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL 菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個(gè)）
三、器材
1、菌種
釀酒酵母
2、儀器或其他用具
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。
四、操作步驟
1、菌懸液制備
以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/span>
2、鏡檢計(jì)數(shù)室
在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3、加樣品
將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。
4、顯微鏡計(jì)數(shù)
加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10 個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5 個(gè)中格(可選4 個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。
5、清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板
使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。
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關(guān)于如何購買生物顯微鏡，對于一些接觸過顯微鏡的人來說還是比較容易的，但是對于一些新接觸顯微鏡的客戶來說是比較難的，為了不讓客戶走彎路，直接買到合適自己使用的顯微鏡，下面我們來介紹下具體購買顯微鏡的基本過程，和需要注意的幾個(gè)因素，這樣的選購的時(shí)候就不會那么迷茫了。
1.要選擇自己合適的生物顯微鏡，主要是看自己拿來看什么的，怎么樣看都需要什么，，什么樣品，透光不透光等
2.選好生物顯微鏡以后，就要選擇外觀了，這里的外觀不是說儀器的美觀程度，而是你在看試樣的時(shí)候方便程度，你要看標(biāo)準(zhǔn)試樣還是看不規(guī)則試樣，此點(diǎn)很重要，標(biāo)準(zhǔn)試樣就用正置的，不規(guī)則的就倒置的。總所周知，正置顯微鏡物鏡和載物臺的距離是規(guī)定了的，也即是說選了這類儀器以后，不管你愿意不愿意，都要把試樣做成標(biāo)準(zhǔn)的那種，否則你看不到試樣的，倒置的就不同了，你只需要把要看的那個(gè)面磨平就可以看了
2.顯微鏡功能：您如果只要求單一的明場，一個(gè)簡單的儀器就可以滿足您的要求，如果您還需要暗場，或者相稱這些功能，都要把他考慮進(jìn)去，把他寫到儀器采購要求里面，這樣買過來的儀器才好用，要不會很麻煩的。
3.效果，顯微鏡分單目，雙目，和三目。如何買到合適的生物顯微鏡
當(dāng)然，并不是說三目的需要用三只眼睛看，也是用兩只眼睛，但是三目的目的是可以連接成像系統(tǒng)，和電腦、電視或者顯示器連接，三目的多用于工廠檢測、實(shí)驗(yàn)室、學(xué)校老師教學(xué)用，單目的比較適合學(xué)生用如何買到合適的生物顯微鏡
5.價(jià)格.服務(wù).售后：這些也是比較重要的如何買到合適的生物顯微鏡
價(jià)格要貨比三家，確定是同樣的東西，同樣的配置，然后再看價(jià)錢，看服務(wù)，看售后
試問，客戶拿錢去買東西，遇到的卻是不冷不熱的待遇，或者遇到?jīng)]有保障的商家，誰還愿意拿錢去買他家東西，就算買回來，在以后的售后問題上還不知道會出什么樣的事情
對于確實(shí)不懂的客戶，可先和銷售聯(lián)系，了解一些基本的東西，然后在根據(jù)自己的需求來選擇，選擇好以后，再找技術(shù)來核實(shí)一下看合適不合適，這樣你才能夠真正的了解顯微鏡。否則買回來也不怎么好用。
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