熒光顯微鏡的技術(shù)應(yīng)用對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性位、半定量研究
1）免疫熒光技術(shù)
用熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣品（細(xì)胞、組織或分離的物質(zhì)等）中相應(yīng)特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(shù)（direct immunofluorescent technique）”。用熒光染料標(biāo)記的第二、第三抗體等檢測相應(yīng)抗原抗體復(fù)合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(shù)（in direct immunofluorescent technique）”。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。
2）分子標(biāo)記
利用綠色熒光的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。
3）藥物篩選
熒光探針分布是利用信號傳導(dǎo)中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對細(xì)胞毒性較小，因而常用作熒光探針。
在活細(xì)胞中的應(yīng)用和發(fā)展
1885年，Ehrlich用亞甲基藍(lán)作為第一個重要的活體染料，并闡明了它對神經(jīng)組織的親和性。吖啶染料是治療錐蟲的有效藥物，Ehrlich用吖啶黃素對付老鼠體內(nèi)的這種原生動物，并取得了顯著效果。這種染料也因其能影響錐蟲而被稱為“錐黃素”。顯微鏡學(xué)家用明視野顯微鏡觀察了這類染料和微生物體的結(jié)合。
熒光顯微鏡下的血涂片觀察表明，染料和核酸及帶血錐蟲的基本部分有特異結(jié)合。20世紀(jì)30年代由于對化療特別感興趣，人們作了各種努力，試圖確定染料在什么位置和動物及人體內(nèi)的瘧原蟲結(jié)合。人們在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，在所試驗(yàn)的各種熒光探針中，奎時因( quinacrine,即米帕林)在注射后的10s內(nèi)能被循環(huán)淋巴液選擇吸收。把吖啶黃素加到成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，在顯微鏡下可看到，試驗(yàn)濃度下它能阻止細(xì)胞的分裂。用熒光吲哚碳花青染料標(biāo)記脂蛋白可在體外研究動脈粥樣化形成過程中脂蛋白的代謝。
通過這些研究，人們明白某些氨基吖啶能優(yōu)先和細(xì)胞核成分結(jié)合。對這種結(jié)合機(jī)理的研究，導(dǎo)致了染料對核酸的親和力的發(fā)現(xiàn)。這種強(qiáng)相互作用已被體外及低pH區(qū)固定細(xì)胞中的純化核酸所闡明。
金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡鏡，它具有穩(wěn)定性好、成像清晰、分辨率高、視場大而平坦的特點(diǎn)。
因其對被測物進(jìn)行既定性又定量地進(jìn)行分析，故對金相顯微鏡的校準(zhǔn)工作必不可少。
金相顯微鏡的校準(zhǔn)：
為了提高我國的材料研發(fā)制造水平，我們必須對金相顯微鏡進(jìn)行校準(zhǔn)或檢定。金相顯微鏡主要分為光學(xué)式金相顯微鏡、數(shù)碼金相顯微鏡、便攜式視頻金相顯微鏡、萬能金相顯微鏡、圖像分析儀等。
1、金相顯微鏡的溯源由于各種金相顯微鏡的用途不同，故其類型、結(jié)構(gòu)及精度亦不同，因而溯源關(guān)系和方式也不同。通過不同的技術(shù)手段和方法，我們最終可溯源到“單刻線樣板標(biāo)準(zhǔn)器組”和“0.01mm標(biāo)準(zhǔn)測微尺”標(biāo)準(zhǔn)器組。
2、金相顯微鏡校準(zhǔn)項(xiàng)目的設(shè)立
（1）物鏡場曲將一物鏡安裝好，將0.01mm標(biāo)準(zhǔn)測微尺放在工作臺上并壓緊；旋轉(zhuǎn)調(diào)焦旋鈕，將焦點(diǎn)調(diào)整在測微尺的中間，視場中心成像清晰，此時將千分表測頭與工作臺表面相接觸并對好表的零位；
再次旋轉(zhuǎn)調(diào)焦旋轉(zhuǎn)，把焦點(diǎn)調(diào)整到測微尺的邊緣，使視場邊緣成像清晰。
觀察千分表，其最大偏移量即為該物鏡的場曲誤差，其余物鏡以此類推進(jìn)行校準(zhǔn)。物鏡場曲誤差的指標(biāo)如下：10X<0.2mm、25X<0.1mm、40X<0.07mm、63X<0.065mm、100X<0.04mm
（2）物鏡放大倍數(shù)的正確性裝上10X標(biāo)準(zhǔn)目鏡和被檢物鏡，將0.01mm標(biāo)準(zhǔn)沒微尺放在工作臺上并壓緊。觀察時測微尺應(yīng)與目鏡中的分劃板相符合，其偏移量測是放大倍數(shù)的誤差。其余物鏡以此類推進(jìn)行校校準(zhǔn)，其誤差不大于5%
（3）目鏡分劃板的準(zhǔn)確度將帶分劃板目鏡的鏡頭旋下，把分劃板放置在萬工顯工作臺上并調(diào)好焦距；調(diào)整工作臺，使分劃板的水平線與萬工顯縱向?qū)к壭谐唐叫胁昧阄?，按?0格測量一次，直到第100格，其誤差不大于5um
（4）物鏡成像清晰范圍用被檢物鏡及10X目鏡對測微尺或金相試樣進(jìn)行調(diào)焦，使成像清晰。當(dāng)視場中心像清晰時，測得視場內(nèi)的成像清晰范圍的誤差不低于60%
（5）各物鏡相對于目鏡的格值裝上被檢儀器的10X目鏡，將0.01mm標(biāo)準(zhǔn)測微尺(推薦使用隨機(jī)0.01mm測微尺)放在工作臺上并壓緊；
調(diào)整測微尺標(biāo)尺軸線與儀器目鏡分劃板標(biāo)尺軸線平行，并讀出目鏡分劃板i條刻線里包含測微尺n條刻線數(shù)，該物鏡相對于目鏡的格值為：C=n/i*0.01mm.其余物鏡的格值以此類推進(jìn)行校準(zhǔn)。
金相顯微鏡是是廣泛用于冶金、機(jī)械加工、科技等行業(yè)的測量儀器。它可以測量金屬材料金相組織奧氏體的晶粒度級別、材料熱處理后滲碳層的厚度等。
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