國產(chǎn)液相色譜柱的色譜填料選擇解析國產(chǎn)液相色譜柱的構(gòu)造由柱管、填料壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2-20µm(5-10µm),取決于填料粒度，目的是防止填料漏出?，F(xiàn)代液相色譜中，分離效果好壞的一個重要指標(biāo)是色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，因此，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解：1.硅膠基質(zhì)填料①正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2，APS）和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份z先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷，CHCl3，二氯甲烷等。②反向色譜反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分z先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反向填料有：C18、C8、C4、C6H5等。2.聚合物填料聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(yōu)點是在PH值為1-14均可使用。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。現(xiàn)有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。3.其它無機(jī)填料其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途。如石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可以在PH高達(dá)12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH1-14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料是近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行之中。

1、泵正常工作時，在流動相和流速不變的前提下柱壓應(yīng)該是穩(wěn)定的，當(dāng)然在換流動相時壓力變化是正常的，正常情況下如果柱壓升高基本上都是由色譜柱使用時間長引起的（只有更換色譜柱），如果正常情況下壓力突然降低有可能是（1）接頭處有漏液的地方，采取的方法是有濾紙檢查，如有漏液的地方用扳手?jǐn)Q緊即可。如果沒有漏液則可能是（2）白色的管子里面有氣泡從而導(dǎo)致流動相進(jìn)不到泵里面去，采取的方法是排氣泡。排氣時:先STOP停泵--打開排氣閥--按PURGE（快沖）鍵--等氣泡排完后先STOP停泵--擰緊排氣閥，其先后步驟不要搞反了。

2、泵正常工作時zui高壓力不要超過200KG，所以打開泵以后可以將泵的zui大壓力調(diào)到200KG，這樣如果壓力超過上限則會自動報警停機(jī)，流速不用超過1ML/MIN，如果使用時壓力超過200KG，建議將流速調(diào)低點以降低壓力（在色譜柱正常的情況下），如果是因為色譜柱長時間使用造成壓力升高則建議更換色譜柱（因為色譜柱屬于耗材長時間使用就需要更換，更換的主要依據(jù)色譜柱出峰不正?；蛘咧鶋毫^高）。

3、泵正常工作時平均每15天左右向注油孔加潤滑油2-3滴。

4、流動相里面如果有鹽或酸類，做完實驗后要先用95%二次蒸餾水與5%甲醇洗色譜柱40分鐘左右，然后用純甲醇洗30分鐘左右才可以關(guān)機(jī)。第二天如果繼續(xù)做實驗流動相里面仍舊有鹽或酸類，先用95%二次蒸餾水與5%甲醇過渡20分鐘，再用流動相。如果流動相里面只有甲醇，水，乙腈，做完實驗后就不用95%二次蒸餾水5%甲醇沖洗，可直接用純甲醇洗30分鐘即可關(guān)機(jī)。

5、C18色譜柱的耐酸PH值范圍3-8使用時不要超出。

6、儀器長期不用時一定要將濾頭泡在甲醇里半月開機(jī)一次，如果開機(jī)時泵抽不上液可以打開排氣閥按PURGE快沖。

7、調(diào)反壓器時要注意等液體流出來以后才能調(diào)，一般調(diào)8--10KG，比如現(xiàn)在泵顯示屏顯示柱壓50KG那再增加10KG顯示屏上顯示柱壓60KG然后擰緊鎖緊螺母。

8、關(guān)機(jī)順序：清洗液路時可以把檢測器直接關(guān)機(jī)，清洗結(jié)束后先按STOP讓泵停止后再關(guān)電源，不允許直接關(guān)機(jī)

高效液相色譜儀操作步驟

　　高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。與經(jīng)典的液相色譜相比，具有高效液相所用的固定相粒度?。?um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高的優(yōu)勢。近年來，在保健食品功效成分、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80％的有機(jī)化合物可以用HPLC來分析測定。

　　高效液相色譜的分離過程HPLC，借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

　　高效液相色譜儀操作步驟：

　　1)過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。

　　2)對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。

　　3)打開HPLC工作站(包括計算機(jī)軟件和色譜儀)，連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。

　　4)進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進(jìn)入手動菜單。

　　5)一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10ml/min。

　　6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。

　　7)設(shè)計走樣方法。點擊file，選取selectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊newmethod。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。

　　8)進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。

　　9)關(guān)機(jī)時，先關(guān)計算機(jī)，再關(guān)液相色譜。

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