高效液相色譜儀測定氨基酸的含量
1  L--色氨酸含量的測定
1.1 實驗儀器與試劑
色氨酸樣品，甲醇， STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站，0.03%KH2PO4溶液
1.2 HPLC色譜分析條件
流動相為0.03%KH2PO4溶液（A）-甲醇（B），線性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱溫 35℃，檢測波長276nm。
流動相 時間（t/min）
 5 10 15 20
A（%） 80 90 80 70
B（%） 20 10 20 30
1.3 標準溶液的配制
精密稱取色氨酸標準標準品50mg，置100ml容量瓶中，振搖，用流動相溶解到刻度，作為供試品溶液，另取色氨酸樣品適量，同法操作。
1.4 標準直線的制作
精密稱取色氨酸標準樣品適量 ,分別稀釋制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色譜儀，以色氨酸峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標，制作回歸標準直線。
1.5 發(fā)酵液中樣品中色氨酸含量的測定
取發(fā)酵液，稀釋配制成約 500μg/ ml 的溶液，搖勻，過濾，取25μl進樣，在高效液相色譜儀下測量，記錄峰值面積，作圖。
2 L-精氨酸含量的測定
2.1 實驗儀器與試劑
L-精氨酸標準樣品，乙腈， STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站，磷酸二氫銨。
PH計，磷酸，
2.2 　HPLC色譜分析條件
流動相: 以磷酸二氫銨溶液 ( 稱取磷酸二氫銨1.15g, 加水800m溶解后, 用磷酸調節(jié)pH 值至2.0±0.1, 加水稀釋至 1000ml ) - 乙腈為流動相，線性梯度淋洗; 柱溫為30℃檢測波長為206nm；進樣量：25μl。
2.3 標準直線的制作
精密稱取精氨酸標準標準品50mg，置100ml 容量瓶中，振搖，用流動相溶解到刻度，作為供試品溶液，另取色氨酸樣品適量，同法操作。精密稱取精氨酸標準樣品適量 ,分別稀釋制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色譜儀，以精氨酸峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標，制作回歸標準直線。
2.4 發(fā)酵液中樣品中精氨酸含量的測定
取發(fā)酵液，稀釋配制成約 500μg/ ml 的溶液，搖勻，過濾，取25μl 進樣，在高效液相色譜儀下測量，記錄峰值面積，作圖。

3 L-甘氨酸含量的測定
3.1 實驗儀器和試劑
    乙酸銨溶液；乙腈；L-甘氨酸標準樣品； STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站。
3.2 ＨＰＬＣ色譜分析條件
流動相:A為0.02%mol/L乙酸銨溶液（PH=6.5）:B為乙腈，線性梯度淋洗；流速: 110 mL/min ；柱溫:30℃；進樣量:２0μL。
梯度洗脫表3
流動相 時間（t/min）
 10 20 30 40 50 60
A（%） 80 60 40 40 60 80
B（%） 20 40 60 60 40 20
3.3 標準直線的制作
方法同2.2節(jié)
3.4 發(fā)酵液中樣品中甘氨酸含量的測定
     方法同2.5節(jié)

4 L-甲硫氨酸含量的測定
4.1   實驗儀器和試劑
   L-甲硫氨酸標準樣品；甲醇；醋酸鈉； STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站。
4.2   HPLC色譜分析條件
流動相: A為甲醇 , B為 50 mmol /L的醋酸鈉緩沖溶液;流速1 . 0 mL /min;梯度洗脫見表1，測定波長為 262 nm，柱溫為30℃。
梯度洗脫表4
流動相                 時間（t/min）
 10 20 30 40 50 60
A（%） 30 50 80 85 100 100
B（%） 70 50 20 15 0 0
4.3   標準直線的制作
方法同2.2節(jié)
4.4   發(fā)酵液中樣品中甲硫氨酸含量的測定
     方法同2.5節(jié)
5 回收率實驗
　 稱取甘氨酸標準液50μg/ml分別稀釋0、1、2、4、6、8、10倍，每份取1ml，按標準樣品處理方法，過濾，測定標準樣品中的甘氨酸的含量，計算回收率。

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　　液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC）及液-固色譜(LSC）?，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有、快速、靈敏等特點。　　
　　液相色譜儀19個常見故障的排除方法：
　　
　　1.操作過程若發(fā)現(xiàn)壓力很小，則可能管件連接有漏，注意檢查。當出現(xiàn)錯誤警告(各組件指示燈均為紅色)，一般為漏液，其中一個感應器中已有溶劑，漏液故障排除后，擦干，點擊Online操作界面中的Instrument/SystemOff，然后再點擊操作界面中的Instrument/SystemOn即可；
　　
　　2.連接柱子與管線時，應注意擰緊螺絲的力度，過度用力可導致連接螺絲斷裂。柱接頭處易發(fā)生漏液，可能情況為接頭Fittings中間的管子未和接口處貼緊。不同廠家的管線及色譜柱頭結構有差異，不要混用，必要時可使用PEEK管及活動接頭；
　　
　　3.操作過程若發(fā)現(xiàn)壓力非常高，則可能管路已堵，應先卸下色譜柱，然后用分段排除法檢查，確定何處堵塞后解決。若是保護柱或色譜柱堵塞，可用小流量流動相或以小流量異丙醇沖洗，還可采用小流量反沖的辦法(新柱不提倡)，若還是無法通暢，則需換柱；
　　
　　4.運行過程中自動停泵，可能為壓力超過上限或流動相用完；
　　
　　5.樣品瓶中樣品較少，自動進樣器進樣針無法到達液面，可采用調低進樣針進樣高度的辦法，注意設置時不要使進樣針碰到瓶底，微量樣品分析應使用微量樣品瓶；
　　
　　6.自動進樣器進樣針未與樣品瓶瓶口對準時，需重新定位；
　　
　　7.泵壓不穩(wěn)或流量不準，可能為柱塞桿密封圈問題或sealwash墊圈問題，需更換；
　　
　　8.基線產(chǎn)生不規(guī)則噪聲，可能原因為系統(tǒng)不穩(wěn)定或沒達到化學平衡(使其平衡，若用離子對試劑，在使用使需要足夠的時間和溶劑體積，色譜柱才能達到足夠的平衡)，流動相被污染(更換流動相，清洗儲液器、過濾器，沖洗并重新平衡系統(tǒng))，色譜柱被污染(為證明可能的原因更換系統(tǒng)的色譜柱或使用一根同類的被證明性能好的色譜柱)，檢測器不穩(wěn)定；
　　
　　9.短期有規(guī)則的噪聲，可能原因為泵壓不穩(wěn)或泵脈沖，調節(jié)溶劑不適當(如，兩種溶劑的互溶性問題)，泵入口管路松或堵塞，泵太臟，泵柱塞磨損，檢測器不穩(wěn)定；
　　
　　10.長期有規(guī)則噪聲，可能原因為室溫不穩(wěn)(未使用柱溫箱)或使用柱溫箱不當；
　　
　　11.基線漂移，可能原因為系統(tǒng)不穩(wěn)或沒有達到化學平衡，室溫不穩(wěn)(未使用柱溫箱)，流動相污染或分解，柱污染，檢測池泄漏，系統(tǒng)泄漏，固定相流失(另選流動相，另選色譜柱)，測定的波長選擇錯誤(對溶劑有吸收)，樣品組分保留太長(用強度合適的溶劑清洗色譜柱)，檢測器不穩(wěn)定；
　　
　　12.每次進樣時的保留時間不重復，可能原因為系統(tǒng)不穩(wěn)或未達到化學平衡，由于氣泡、各部件磨損等原因引起的泵壓或泵脈沖輸液不穩(wěn)定，進樣體積太大或樣品濃度太高平衡被破壞，溶劑配比不合適，柱被污染；
　　
　　13.無峰，可能原因為檢測器選擇錯誤，使用錯誤的流動相，樣品降解；
　　
　　14.色譜峰比預計的小，可能原因為進樣體積錯誤，檢測器燈故障，進樣問題(瓶號錯、進樣體積不合適、進樣錯誤、針頭堵塞)；
　　
　　15.峰變寬，可能原因為進樣體積太大或樣品濃度太高，過濾器、保護柱入口、柱入口或連接管路有部分堵塞，檢測器時間常數(shù)設置錯誤，進樣器問題(如，閥漏、針頭堵塞或損壞)，柱或保護柱被污染，對流動相來說樣品溶劑太強，使用錯誤的色譜柱，溫度變化;
　　
　　16.出現(xiàn)雙峰/肩峰，可能原因為保護柱或柱入口部分阻塞，柱或保護柱被污染，柱性能下降，保護柱失效，進樣體積太大或樣品濃度太高(樣品過載)，平衡破壞;
　　
　　17.前沿峰，可能原因為進樣體積太大或樣品濃度太高(樣品過載)，平衡破壞，對于流動相來說樣品溶劑非極性太強(對于反相柱)，柱或保護柱被污染，柱性能下降，保護柱失效;
　　
　　18.脫尾峰，可能原因為柱或保護柱被污染，柱性能下降，保護柱失效，進樣器問題(如，閥漏等)，檢測器時間常數(shù)設置錯誤;
　　
　　19.出現(xiàn)鬼峰，可能原因為流動相被污染，樣品預處理時產(chǎn)生降解或混入雜質，先前進樣的流出物，樣品定量管清洗不當，注射器臟，柱被污染，進樣裝置被污染，流動相中含有穩(wěn)定劑/穩(wěn)定劑變化。水膜和油膜的外殼有標示的。

    液相色譜儀的日常操作條件：溫度：10-40℃；相對濕度<80％；可以是恒溫、恒濕，遠離高電干擾、高振動設備，使用后液相色譜儀檢測器的保養(yǎng)對液相色譜儀的使用壽命影響至關重要。

    微小的顆粒雜質或薄膜沉積在流通池里，會導致基線噪聲的增加或降低靈敏度。此時必須進行清洗處理。一般常規(guī)清洗不必拆下流通池，可直接在流通池入口處（即檢測器輸入端），接上一個專用的注射器接頭，依次用去離子水、酒精和3MHNO3沖洗流通池，最后用去離子水反復沖洗數(shù)次。檢測器出口用玻璃瓶盛接流出的廢液。

    若檢測器已長期使用或受到高濃度樣品的污染，經(jīng)上述方法還不能除去污垢，就得取下流通池，液相色譜儀檢測器的保養(yǎng)按以下步驟拆開進行清洗：

    1)卸下紫外檢測器側面遮蓋流通池的蓋板，松開固定流通池支架的螺釘，小心地取出流通池支架。

    2)拆下連接流通池輸入、輸出端的不銹鋼導管（或PEEK導管），卸下流通池體。仔細擰下石英窗和透鏡的護圈。小心取下墊圈、石英窗、透鏡、護圈，放在一個盛有乙醇的燒杯內，用超聲波清洗機處理5min~10min。

    3)用蒸餾水、乙醇沖洗流通池，并用超聲波清洗，最后用去離子水沖洗數(shù)次，除去池內雜物。

    4）烘干各部件（注意：避免用手直接接觸透鏡及石英窗）。

    5）重新裝配流通池體。

    6)按原樣裝在流通池支架上，并接好導管，并進行試漏。（方法：池體輸入端與恒流泵連接，開啟恒流泵（流動相用蒸餾水），視各密封點及石英窗口是否有漏液溢出。

    7）裝入紫外檢測器機箱內，蓋上蓋板，并用原螺釘、螺帽固定。

    注：上述液相色譜儀檢測器的保養(yǎng)拆洗應有經(jīng)培訓過的專業(yè)維修人員進行。

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