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色譜柱填料粒度的選擇 色譜柱如何操作

時(shí)間：2020-08-31    來源：儀多多儀器網(wǎng)    作者：儀多多商城     
      目前，商品化的色譜填料粒度從1μm到超過30μm均有售，而目前分析分離主要用3、5和10μm填料。填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；然而粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3μm的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小粒度的填料是很有用的。3μm填料填充柱的柱效比相同條件下的5μm填料的柱效提高近30%；然而，3μm的色譜柱的背壓卻是5μm的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，以縮短分析時(shí)間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。
  色譜柱使用前的注意事項(xiàng)　　色譜柱在使用前，應(yīng)進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。　　但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的(出廠測試所使用的條件是較佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。　　樣品的前處理　　a、使用流動(dòng)相溶解樣品。　　b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。　　c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。　　流動(dòng)相的配制　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：　　a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。條件進(jìn)行　　b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。　　c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。　　d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，應(yīng)使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。　　e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。　　f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。　　流動(dòng)相流速的選擇　　因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，較好使用較佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。　　當(dāng)選用較佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。　　注意：　　1．由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。　　2．對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水較好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。　　3．含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。應(yīng)加入氮化鈉，防止細(xì)菌生長。　　4．流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。　　5．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
 　　如何緩解賽默飛色譜柱頻繁損壞的問題　　賽默飛色譜柱具有數(shù)字通訊功能，軟件與儀器的聯(lián)控功能，直接鼠標(biāo)點(diǎn)擊，就可以完成各種檢測。檢測器傳輸采用三級(jí)齒輪減速結(jié)構(gòu)，儀器抗震性能優(yōu)越，防止運(yùn)輸及使用過程震動(dòng)；采用高亮度OLED顯示屏，優(yōu)越的美觀可視效果，超高的質(zhì)量穩(wěn)定性。內(nèi)置氘燈和氘燈，內(nèi)置器件無需更換即可實(shí)現(xiàn)波長從190-850nm轉(zhuǎn)換；儀器使用原裝氘燈，可手動(dòng)關(guān)/開，更換氘燈時(shí)，不必調(diào)整光軸，維護(hù)簡便，氘燈使用壽命長。光路系統(tǒng)采用優(yōu)先的凹面光柵器件、結(jié)合精密定位結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的散熱技術(shù)，使波長精度高，偏移小和穩(wěn)定時(shí)間短，的光學(xué)系統(tǒng)和數(shù)字過濾極大的提高了儀器的靈敏度和結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性并保證了儀器的穩(wěn)定可靠。人性化、便攜化的軟件界面，人機(jī)工程的操作平臺(tái)與按鍵，操作便捷、快速；樣品和參比能量顯示便于故障的判斷和排查；儀器內(nèi)部安全報(bào)警與自動(dòng)故障排查功能，維護(hù)方面快捷。具有波長自動(dòng)校正功能，自動(dòng)調(diào)零，多量程輸出選擇可滿足各濃度分析需求。　　在賽默飛色譜柱的使用中，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)很多實(shí)驗(yàn)室會(huì)面臨色譜柱頻繁損壞的問題。需要來了解一下色譜柱的損壞來源于哪些方面：　　泵頭密封圈的磨損；進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子密封圈的磨損；析出的緩沖鹽；樣品中的復(fù)雜易吸附基質(zhì)等等；其實(shí)，在工作過程中大多數(shù)的顆粒物堵塞導(dǎo)致的色譜柱背壓升高問題是體現(xiàn)在柱頭堵塞。而樣品的易吸附機(jī)制也可能會(huì)和柱前端的硅膠表面游離的硅醇基發(fā)生作用導(dǎo)致色譜柱背壓升高。但是這種情況在較低的PH系統(tǒng)中會(huì)有所改善，因?yàn)檩^低的PH系統(tǒng)會(huì)降低硅膠表面的硅醇基發(fā)生解離。　　預(yù)防措施：　　1、在液相系統(tǒng)中加入在線過濾器　　在線過濾器的內(nèi)部顆粒空隙一般是0.5微米，對(duì)于UHPLC會(huì)選擇0.2微米空隙的在線過濾器。這個(gè)空隙尺寸和柱頭的過濾篩板尺寸接近或者略小。所以，在線過濾器能夠有效的阻隔來自樣品、泵頭密封墊、自動(dòng)進(jìn)樣器的轉(zhuǎn)子密封墊的顆粒物，以防止柱頭過濾篩板的堵塞。注意：但是對(duì)于非常低死體積的液相系統(tǒng)，在線過濾器的加入可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)死體積增大峰展寬變嚴(yán)重的問題。而對(duì)于大多數(shù)的液相系統(tǒng)而言，色譜圖不會(huì)有太大變化。　　2、在柱子前端使用保護(hù)柱　　保護(hù)柱有很多種，通用型、一體式、卡套式，但是它其實(shí)是一個(gè)和分析柱固定相相同的10-20mm的小柱子。因?yàn)樗哂泻头治鲋嗤膬?nèi)部填料，所以保護(hù)柱不僅可以阻隔顆粒物，還可以阻隔易吸附的樣品基質(zhì)組分。注意：由于保護(hù)柱中可能有大量的強(qiáng)保留組分，在用強(qiáng)溶劑清洗系統(tǒng)時(shí)請(qǐng)取下保護(hù)柱，以防止這些強(qiáng)保留組分被洗脫進(jìn)分析柱。保護(hù)柱如果出現(xiàn)吸附飽和也可能會(huì)對(duì)分離效果有影響。　　3、對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理　　有一些液相的分析方法沒有明確標(biāo)注樣品的凈化，但我希望大家在做分析時(shí)都能夠考慮樣品的凈化，常用的方案是對(duì)樣品進(jìn)行過濾。在實(shí)際工作中，賽默飛色譜柱的儲(chǔ)存也會(huì)影響柱子的使用壽命。那么對(duì)于色譜柱的儲(chǔ)存，也有以下建議：　　4、使用時(shí)注意事項(xiàng)：　　.為避免管路中的有機(jī)溶劑和氣泡進(jìn)入色譜柱，先用水沖洗整個(gè)色譜系統(tǒng)，然后才能接入凝膠柱。　　.不要讓有機(jī)溶劑進(jìn)入柱中，否則會(huì)使填料脫水，導(dǎo)致柱床損壞，要小流速開啟泵，不要快速加大流速，以防止壓力迅猛升高而導(dǎo)致柱床損壞。15mm的柱子流速不要超過3ml/min。　　.每次使用后務(wù)必用蒸餾水沖洗干凈將含鹽的流動(dòng)相置換干凈，若較長時(shí)間不用請(qǐng)按保存方法保存。　　5、保存方法：　　.將凝膠柱用蒸餾水沖凈后充上0.02%-0.05%的疊氮鈉水溶液封存，或三氯丁醇苯基汞代鹽將色譜柱封閉后低溫保存(溫度在5℃左右)在冰箱。　　.再次使用時(shí)，用蒸餾水將保護(hù)溶液沖洗掉即可使用。　　.如果次日還要使用也要從系統(tǒng)中取下，將賽默飛色譜柱封閉后存于4~8度的冰箱中冷藏。

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