液相色譜儀分離的目的必須十分明確，下面的問題在建立方法之初就應(yīng)確定：　?。?）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時(shí)做？；　?。?）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測(cè)定結(jié)果更加可靠，但卻沒必要將它們彼此完全分開。　?。?）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度通常能達(dá)到±1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況。　?。?）特殊化合物可能會(huì)以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？　?。?）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時(shí)處理大量樣品時(shí)，運(yùn)行時(shí)間將變得非常重要?！　∮袝r(shí)甚至為了縮短運(yùn)行時(shí)間而以犧牲樣品分離度作代價(jià)，如縮短柱長(zhǎng)或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過10個(gè)，運(yùn)行時(shí)間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)?！　。?）將要使用該方法的實(shí)驗(yàn)室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計(jì)與生產(chǎn)的設(shè)備上運(yùn)行？　　方法建立實(shí)驗(yàn)開始之前，應(yīng)明確對(duì)方法的這些要求。

日立液相色譜只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。

　　日立液相色譜成為解決生化分析問題有前途的方法。由于液相色譜儀具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。日立液相色譜與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。

　　日立液相色譜常用的脫氣方法有以下幾種：

　　1、吹氦脫氣法使用在液體中比空氣溶解度低的氦氣，在0、1Mpa壓力下，以約60ml/min流速通入流動(dòng)相10-15min以驅(qū)除溶解的氣體。此法使用于所有的溶劑，脫氣效果較好，但在國(guó)內(nèi)因氦氣價(jià)格較貴，本法使用較少；

　　2、加熱回流法此法的脫氣效果較好；

　　3、抽真空脫氣法此時(shí)可使用微型真空泵，降壓至0、05-0、07MPa即可除區(qū)溶解的氣體。顯然使用水泵連接抽濾瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成過濾機(jī)械雜質(zhì)和脫氣的雙重任務(wù)。由于抽真空會(huì)引起混合溶劑組成的變化，故此法適用于單一溶劑體系脫氣。對(duì)多元溶劑體系應(yīng)預(yù)先脫氣后再進(jìn)行混合，以保證混合后的比例不變。

　　4、超聲波脫氣法它是目前實(shí)驗(yàn)室使用廣泛的脫氣方法，將配制好的流動(dòng)相連同容器一起放入超聲波水漕中脫氣10-20min即可。該方法操作簡(jiǎn)便，基本能滿足日常分析的要求。

　　5、在線真空脫氣法把真空脫氣裝置串聯(lián)到儲(chǔ)液系統(tǒng)中，并結(jié)合膜過濾器，實(shí)現(xiàn)了流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣。此法的脫氣效果明顯優(yōu)于上述幾種方法，并適用于多元溶劑體系。

　　在日立液相色譜系統(tǒng)開始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽入流動(dòng)相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈。在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。