反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來(lái)分離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保留方式分離。固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相（例如苯基－己基）、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相－也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚 合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無(wú)機(jī)－有機(jī)混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

      反相色譜柱利用各種流動(dòng)相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時(shí)候這些添加物有可能會(huì)污染鍵合相表面。硅膠表面因?yàn)橛兄杷I合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別 是堿性成分。因?yàn)楣柰榇嫉膒Ka值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽(yáng)離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金 屬離子（有時(shí)候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如 C2或C4上更讓人煩惱。使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時(shí)才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常 疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填表面并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努 力來(lái)保護(hù)HPLC柱子，某些分析物－基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒(méi)被污染的柱子會(huì)有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓?jiǎn)栴}。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來(lái)的操作條件。這部分的"柱子觀察"將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來(lái)的或差不多原來(lái)的狀態(tài)。因?yàn)殒I合硅膠柱子是 較受歡迎的，我重點(diǎn)講述這種柱子。

       最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。 什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來(lái)說(shuō)不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時(shí)與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來(lái)說(shuō)在空體積時(shí)就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測(cè)器檢測(cè)到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保留而且流動(dòng)相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來(lái)，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。這些行為通常只有通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。 有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開(kāi)始形成新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理。保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過(guò)泵所能承受的最大壓力，使柱子無(wú)法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)去除。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡(jiǎn)單的步驟來(lái)除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過(guò)多次操作以后的色譜柱用90～100％的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個(gè)體積可以清除污染物。例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫 呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問(wèn)題如柱頭 堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）。沖洗5～10個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒(méi)法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來(lái)清洗柱子了，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過(guò)一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁(yè)上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。一般來(lái)說(shuō)，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來(lái)溶解非極性物質(zhì) 如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。

      清洗過(guò)程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如， 異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測(cè)器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。對(duì)于典型的硅膠鍵合柱來(lái)說(shuō)如果沒(méi)有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列： 100％甲醇 100％乙晴 75％乙晴－25％異丙醇 100％異丙醇 100％二氯甲烷 100％正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來(lái)的水相溶劑。每種溶劑至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積。如250mm×4.6mmHPLC 分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速來(lái)沖洗，要回復(fù)原來(lái)的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過(guò)中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒(méi) 有緩沖的流動(dòng)相，最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜（DMSO）或 者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過(guò)色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過(guò)程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過(guò)夜操作。

    自動(dòng)進(jìn)樣器的故障容易被發(fā)現(xiàn)，有時(shí)液相色譜儀系統(tǒng)出了故障而不能確定是否是進(jìn)樣器故障，可以用手動(dòng)進(jìn)樣幾次，或用一臺(tái)好的自動(dòng)進(jìn)樣器代替，如排除了故障，說(shuō)明自動(dòng)進(jìn)樣器有了問(wèn)題。不同廠商的自動(dòng)進(jìn)樣器差異很大，除一些共性故障外，較好查閱操作手冊(cè)或與供應(yīng)商聯(lián)系。

    除自動(dòng)進(jìn)樣器機(jī)械、控制系統(tǒng)可能出現(xiàn)故障外，在操作及方法學(xué)方面也可能出現(xiàn)相應(yīng)的問(wèn)題，這里主要根據(jù)自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)特點(diǎn)，對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行說(shuō)明。

    一、滯后體積

    高效液相色譜儀中滯后體積是指流動(dòng)相混合器到柱頭的體積，包括溶劑混合器和混合器到柱頭之間連接管的體積，對(duì)于低壓混合系統(tǒng)，也包括泵體積。滯后體積較大可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差、方法移植困難。通常的HPLC系統(tǒng)中，滯后體積一般在0.2mL～5mL之間，主要取決于裝置的設(shè)計(jì)。

    滯后體積中較重要的部分為自動(dòng)進(jìn)樣器的定量環(huán)體積。只有定量環(huán)體積小于100μL時(shí)，其對(duì)滯后體積的影響才可以近似不計(jì)。當(dāng)定量環(huán)體積較大時(shí)，這種影響將表現(xiàn)出來(lái)。例如，采用50μL的定量環(huán)時(shí)滯后體積為300μL，如果改用1mL定量環(huán)，滯后體積將變成1250μL，這種變化直接影響到色譜分離結(jié)果。在實(shí)際分離過(guò)程中，采用的色譜柱較細(xì)時(shí)，必須考慮滯后體積的影響，解決的辦法為更換較小的定量環(huán)，減小滯后體積。

    二、樣品瓶過(guò)滿

    如果樣品瓶過(guò)滿，在瓶蓋較緊、進(jìn)樣量較大的情況下，可能會(huì)導(dǎo)致進(jìn)樣重復(fù)性變差。其原因?yàn)闃悠菲恐械臉悠繁怀槌鰰r(shí)，蓋緊的瓶蓋不能使空氣及時(shí)進(jìn)入，造成部分真空。由于這種真空作用，注射器不能夠吸取足夠量的樣品體積。在極端的情況下，對(duì)于揮發(fā)性稀溶液樣品，針內(nèi)甚至?xí)霈F(xiàn)氣泡，影響分析工作的正常進(jìn)行。

    有些自動(dòng)進(jìn)樣器采用加排空針的方法克服這一問(wèn)題，但這種方法并不常用。較簡(jiǎn)單的解決辦法為不要使樣品瓶過(guò)滿。一般裝樣量在樣品瓶的1／2到3／4之間較為適宜。

    三、進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)

    樣品量足夠多時(shí)，不必考慮這一問(wèn)題。但對(duì)于痕量分析而言，進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)問(wèn)題將較為突出。理想的情況下可以使進(jìn)針深入到接近樣品瓶底部，這樣可以較大限度地利用樣品。當(dāng)可用的樣品體積有限時(shí)，可以采用微量樣品瓶以增加給定體積樣品的相對(duì)深度。如果進(jìn)針過(guò)深，可能插入樣品瓶的底部，甚至導(dǎo)致針尖阻塞。如果進(jìn)針深度不足，樣品只及針尖部分，針將不能抽取足夠量的樣品，部分空氣取而代之。

    對(duì)于進(jìn)針深度的調(diào)節(jié)，一般采用機(jī)械或電動(dòng)的方法，目前大部分廠商可以在液相色譜儀色譜工作站上設(shè)置。無(wú)論采用哪種方法，實(shí)驗(yàn)之前都必須認(rèn)真調(diào)節(jié)，更換樣品瓶類型時(shí)還需要重新調(diào)整。

三個(gè)延長(zhǎng)液相色譜柱使用壽命的方法

　　色譜柱是化學(xué)實(shí)驗(yàn)中較為常見(jiàn)、常用的化工儀器之一，正確而有效的使用方法，不僅能夠延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，也能確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

　　1、“保護(hù)柱”的使用

　　保護(hù)柱是很短的色譜柱，填裝和液相色譜柱相同的填料。正確使用”保護(hù)柱”，可以起到阻攔一些容易損壞液相色譜柱的物質(zhì)的作用。從而達(dá)到延長(zhǎng)柱子壽命的效果。相反，如果使用”保護(hù)柱”不當(dāng)，可能會(huì)縮短色譜柱的使用壽命。例如，在保護(hù)柱使用過(guò)程中，如果污染達(dá)到一定程度而沒(méi)有及時(shí)更換，累積的雜物很可能會(huì)沖入色譜柱中，反而會(huì)造成色譜柱損壞。因此，在使用”保護(hù)柱”時(shí)，較為重要的是要知道什幺時(shí)候該換保護(hù)柱。該換的時(shí)候就必須要立即更換。

　　2、選擇高品質(zhì)的柱子

　　一般認(rèn)為同一廠牌、同一型號(hào)的柱子之間的品質(zhì)都相同，對(duì)品質(zhì)管理很嚴(yán)格的廠家而言，這說(shuō)法是成立的。但如果廠家品質(zhì)管理不夠嚴(yán)格，即使是同一批號(hào)的新柱子之間的品質(zhì)也有差異。所以，選用柱子時(shí)必須選擇管理嚴(yán)格的高品質(zhì)柱子，我們知道，任何柱子使用過(guò)后都會(huì)產(chǎn)生變化。尤其如在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下使用，柱子更易產(chǎn)生變化。因此，應(yīng)盡量選用pH適用范圍大的柱子。在開(kāi)發(fā)新分析方法時(shí)，許多專家建議不要使用舊柱子。因柱子一經(jīng)使用。柱性會(huì)改變；如此一來(lái)，使用舊柱子開(kāi)發(fā)出來(lái)的新分析方法，很可能在再使用同廠牌的新柱子分析時(shí)。發(fā)生無(wú)法達(dá)到預(yù)定效果的情況?？偟恼f(shuō)。開(kāi)發(fā)新分析方法時(shí)要使用品質(zhì)好的新柱子；并且一支柱子可以使用在一種分析方法上；則柱子壽命可以延長(zhǎng)。

　　3、定期沖洗色譜柱

　　一般柱子使用一段時(shí)間后總會(huì)有一些雜質(zhì)累積在柱內(nèi)，而且這些雜質(zhì)不會(huì)隨著流動(dòng)相出來(lái)，會(huì)逐漸影響柱子的品質(zhì)。這些雜質(zhì)在后來(lái)的分析譜圖上出現(xiàn)。從而造成出現(xiàn)怪峰、基線不平等現(xiàn)象。簡(jiǎn)單的解決方法是用較強(qiáng)的流動(dòng)相沖洗。而且每次分析某一產(chǎn)品完成后沖洗。如果分析時(shí)使用緩沖劑﹐可以用水來(lái)取代緩沖劑。先使用有機(jī)和水的混合溶液為流動(dòng)相沖洗緩沖劑。接著再用100%有機(jī)溶劑沖洗。如果直接用100%有機(jī)溶劑沖洗的話，緩沖劑很可能會(huì)沉淀出來(lái)，而損壞柱子的品質(zhì)。使用10-20倍柱體積的量來(lái)沖洗基本就足夠了?？梢詫?00%有機(jī)溶劑沖洗的條件加在分析實(shí)驗(yàn)程序完畢后，如此一來(lái)每天在開(kāi)機(jī)前都會(huì)用100%機(jī)溶劑沖洗。一般硅膠柱可以反沖洗處理﹐即是在將沖洗前將柱子倒反接后再?zèng)_洗。打算使用反沖洗處理前，可以先參考柱子的保養(yǎng)說(shuō)明書(shū)。所以要真正保護(hù)柱子，使柱子的壽命延長(zhǎng)，可以是使用”保護(hù)柱”和定期沖洗柱子。