色譜柱的使用

色譜柱在使用前，可以進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是較佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理
　a、可以使用流動(dòng)相溶解樣品。
　b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
　c、使用0.45?m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制
　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
　　a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。
　　b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
　　c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
　　d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，可以使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
　　e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
　　f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇
　　因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，可以使用較佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
　　當(dāng)選用較佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

疏水色譜柱是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動(dòng)相洗脫時(shí)，各組分遷移速度不同而達(dá)到分離的目的。流動(dòng)相一般為pH 6-8的鹽水溶液，具有對(duì)蛋白質(zhì)的回收率高，蛋白質(zhì)變性可能性小等優(yōu)勢(shì)。由于流動(dòng)相中不使用有機(jī)溶劑，也有利于蛋白質(zhì)保持固有的活性。 疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復(fù)雜的生物樣品。目前該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段。 疏水色譜柱的影響因素有哪些？ 1、鹽類和鹽組成鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應(yīng)增大。各種鹽離子和離子對(duì)具有破壞周圍水分子有序排列的能力。 流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有為重大的影響。選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。 2、離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強(qiáng)度來增加組分的保留值，降低離子強(qiáng)度來提高組分的解析附能力。HIC實(shí)驗(yàn)中，改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。 3、溶液的酸堿度溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。 4、柱溫一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過提高柱溫來增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。
　　什么情況下需要對(duì)色譜柱做老化處理
檢測(cè)色譜柱安裝和系統(tǒng)檢漏工作完成后，就可以對(duì)色譜柱進(jìn)行老化了。
1．老化的方法：
老化的方法通常是將色譜柱升至一恒定溫度，通常為其溫度上限。特殊情況下，可加熱至使用溫度之上約10～20℃左右，但是一定不能超過色譜柱的溫度上限，那樣極易損壞色譜柱。
當(dāng)?shù)竭_(dá)老化溫度后，記錄并觀察基線。初始階段基線應(yīng)持續(xù)上升，在到達(dá)老化溫度后5～10分鐘開始下降，并且會(huì)持續(xù)30～90分鐘。當(dāng)?shù)竭_(dá)一個(gè)固定的值后就會(huì)穩(wěn)定下來。如果在2～3小時(shí)后基線仍無法穩(wěn)定或在15～20分鐘后仍無明顯的下降趨勢(shì)，那么有可能系統(tǒng)有泄漏或者污染。遇到這樣的情況，應(yīng)立即將柱溫降到40℃以下，盡快的檢查系統(tǒng)并解決相關(guān)的問題。如果還是繼續(xù)的老化，不僅對(duì)色譜柱有損壞而且始終得不到正常穩(wěn)定的基線。
另外，老化的時(shí)間也不宜過長，不然會(huì)降低色譜柱的使用壽命。一般來說，涂有極性固定相和較厚涂層的色譜柱老化時(shí)間長，而弱極性固定相和較薄涂層的色譜柱所需時(shí)間較短。
2. 設(shè)置確認(rèn)載氣流速
對(duì)于毛細(xì)管色譜柱，載氣的種類高純度氮?dú)饣驓錃?。載氣的純度大于99.995%，而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是毛細(xì)管色譜柱，那么依照載氣的平均線速度（cm/sec），而不是利用載氣流量（mL/min）來對(duì)載氣做出評(píng)價(jià)。因?yàn)橹У挠?jì)算采用的是載氣的平均線速度。推薦平均線速度值：氮?dú)猓?0～12cm/sec；氫氣：20～25cm/sec。
在載氣的管線中加入氣體過濾裝置不僅可以延長色譜柱壽命，而且很大程度的降低了背景噪音。建議安裝一個(gè)高容量脫氧管和一個(gè)載氣凈化器。使用ECD系統(tǒng)時(shí)，能在其輔助氣路中也安裝一個(gè)脫氧管。
3.柱流失檢測(cè)
在色譜柱老化過程結(jié)束后，利用程序升溫作一次空白試驗(yàn)（不進(jìn)樣）。一般是以10℃/min從50℃升至使用溫度，達(dá)到使用溫度后保持10min。這樣我們就會(huì)得到一張流失圖。這些數(shù)值可能對(duì)今后作對(duì)比試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)問題的解決有幫助。
在空白試驗(yàn)的色譜圖中，不應(yīng)該有色譜峰出現(xiàn)。如果出現(xiàn)了色譜峰，通?？赡苁菑倪M(jìn)樣口帶來的污染物。如果在正常的使用狀態(tài)下，色譜柱的性能開始下降，基線的信號(hào)值會(huì)增高。另外，如果在很低的溫度下，基線信號(hào)值明顯的大于初始值，那么有可能是色譜柱和GC系統(tǒng)有污染。
色譜柱的保存色譜柱用進(jìn)樣墊將色譜柱的兩端封住，并放回原包裝。在安裝時(shí)要將色譜柱的兩端截去一部分，以確保沒有進(jìn)樣墊的碎屑?xì)埩粲谥小?br /> 色譜柱的重新安裝色譜柱重新安裝時(shí),密封要注意：
a.安裝位置(尺寸)要重現(xiàn)，否則引起峰靈敏度變化；
b.安裝時(shí)防止碎渣進(jìn)入色譜柱引起峰形拖尾；
c.不需要擰得太緊；
e.使用清潔的密封墊，避免用手接觸密封墊，以防手上的油脂污染；
f.密封墊安裝前，要仔細(xì)檢查有無損傷，以防安裝后，有問題時(shí)不易拆除；
g.對(duì)那些不宜重復(fù)使用，如石墨密封墊，重新安裝柱時(shí)要注意及時(shí)更換。

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