高效液相色譜柱的故障分析

色譜柱是有使用壽命的。一根正常的商品柱一般可以正常使用2000~5000次進(jìn)樣；保護(hù)良好的柱子可達(dá)10000次以上，但是有時(shí)候即使是一次不當(dāng)使用就可能使柱子發(fā)生嚴(yán)重的損害。柱子受損害后，可表現(xiàn)為柱壓升高、柱效下降、峰形異常等現(xiàn)象。

          1. 柱壓升高

           造成柱壓升高的可能原因有很多。一般是由于柱床內(nèi)產(chǎn)生了異常的占位性物體，造成流體阻力加大所引起的。

          （1）流動(dòng)相過(guò)濾不良        這往往是由于流動(dòng)相沒(méi)有過(guò)濾，或者雖然已經(jīng)過(guò)濾但濾膜孔徑過(guò)大或?yàn)V片損壞，使得固體雜質(zhì)滯留于濾板上所造成的。致使柱的進(jìn)口濾片處堵塞，壓力升高。

          （2）霉菌生長(zhǎng)      霉菌在流動(dòng)相中、管路中或柱子進(jìn)口處繁殖、生長(zhǎng)，堵塞濾板，導(dǎo)致壓力升高。這種現(xiàn)象在夏天，尤其是使用磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相時(shí)更易發(fā)生。在夏季使用磷酸鹽緩沖液時(shí)一般要現(xiàn)配現(xiàn)用。即使保存在冰箱中，一般也不要超過(guò)兩天。否則，即使不堵塞濾板，也會(huì)因細(xì)菌或霉菌孳生而產(chǎn)生的代謝物造成對(duì)樣品的干擾。

          （3）非特異性吸附      當(dāng)溶質(zhì)在柱子上有較強(qiáng)的非特異性吸附，且當(dāng)前所用的流動(dòng)相難以將它們洗脫時(shí)，累積的未洗脫溶質(zhì)也會(huì)造成阻力增大和壓力升高。

          （4）更換流動(dòng)相時(shí)置換不徹底      致使流動(dòng)相不互溶

          （5）鹽晶體的析出       更換流動(dòng)相后，緩沖液在新的流動(dòng)相體系溶解度低而析出

          （6）樣品的沉淀      配制樣品的溶劑與流動(dòng)相不一致時(shí)，樣品進(jìn)入柱中溶解度可能降低而析出

          （7）壓力脈沖      運(yùn)行過(guò)程中，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)內(nèi)壓力的突然升降。如，轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)動(dòng)作過(guò)緩，造成液流堵塞再瞬間釋放；開機(jī)瞬間壓差較高等。壓力脈沖會(huì)造成多孔填料的崩壞和柱床結(jié)構(gòu)的微小變化。填料微屑的長(zhǎng)期累積可能會(huì)使柱床阻力增大。

          2.  柱效下降

           柱子在使用過(guò)程中分離性能逐步降低是正?，F(xiàn)象。但是如果發(fā)生突然降低或改變，屬于異?，F(xiàn)象。此時(shí)，應(yīng)分析原因，有針對(duì)的采取措施，避免這種情況發(fā)生，或及時(shí)進(jìn)行柱子再生，以求盡可能地恢復(fù)其性能。造成柱效下降的原因有很多，但最基本的原因是使用不當(dāng)，造成填料特性或柱床結(jié)構(gòu)的改變所致。

          （1）pH值  流動(dòng)相的pH值是柱子使用中最需要注意的參數(shù)。以硅膠為基質(zhì)的色譜填料通常僅適于在pH值2~8的范圍內(nèi)使用。過(guò)低過(guò)高的pH值都會(huì)造成填料配基脫落或基質(zhì)的溶解。有時(shí)，僅僅是樣品溶液的pH值影響，也會(huì)使柱子性能極大地破壞。

          （2）非特異性吸附 樣品中強(qiáng)極性或具有強(qiáng)非特異性吸附的物質(zhì)有可能吸附于填料表面，形成非特異性吸附層，改變柱子的表面活性，使分離性能發(fā)生變化，并使柱效降低。例如，有些植物色素經(jīng)常會(huì)吸附于柱頭，使柱子進(jìn)口端顏色加深，整體柱效下降；有些蛋白質(zhì)成分會(huì)在柱頭變性而沉淀下來(lái)。

          （3）填料流失     制造不當(dāng)?shù)牧淤|(zhì)濾板，以及上述的壓力脈沖等

          （4）柱外效應(yīng)   過(guò)長(zhǎng)的連接管線、連接管線內(nèi)徑太大、過(guò)大的檢測(cè)池體積、過(guò)大的進(jìn)樣體積等等，均會(huì)造成柱效下降。

          3.  峰形異常

           色譜的譜圖是進(jìn)行色譜分離分析時(shí)的基本結(jié)果和數(shù)據(jù)。在優(yōu)化的條件下，色譜峰應(yīng)是左右對(duì)稱的高斯峰，彼此分離良好，且數(shù)據(jù)具有重復(fù)性。

          （1）分裂峰   分裂峰是峰頂端“分叉”，成為兩個(gè)峰尖。出現(xiàn)這種情況時(shí)，往往所有的峰都發(fā)生分裂，而不是單獨(dú)某一個(gè)峰分裂。分裂峰多是因?yàn)槿肟跒V片上堵塞的固體雜質(zhì)導(dǎo)致樣品溶液流型改變而引起的。此外，柱入口端柱床塌陷和進(jìn)樣時(shí)進(jìn)樣閥切換動(dòng)作不連續(xù)也會(huì)造成譜帶流型分裂而形成分裂峰。

          （2）拖尾峰 拖尾峰多是由于硅膠表面殘留的硅醇基和硅膠基質(zhì)中的金屬離子雜質(zhì)對(duì)極性溶質(zhì)的非特異性吸附而造成的。在使用過(guò)程中，pH值不當(dāng)引起的配基脫落，非特異性吸附造成填料表面活性位點(diǎn)的損失及“新”活性位點(diǎn)的產(chǎn)生等填料表面性質(zhì)的改變，均會(huì)形成拖尾峰。此外，過(guò)大的進(jìn)樣量會(huì)造成非線性吸附，性能已經(jīng)改變的柱子導(dǎo)致相鄰峰的不完全分離也會(huì)形成類似拖尾的峰。

          （3）無(wú)規(guī)雜峰    流動(dòng)相中高保留雜質(zhì)在填料上的累積和慢洗脫，流動(dòng)相長(zhǎng)霉產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，管路和進(jìn)樣閥等部件表面吸附的雜質(zhì)的釋放，前幾次進(jìn)樣后沒(méi)有洗脫的強(qiáng)保留峰在以后的進(jìn)樣時(shí)出的峰，以及樣品分解與變質(zhì)產(chǎn)生的物質(zhì)等（如蛋白質(zhì)樣品降解為肽等），均可產(chǎn)生無(wú)規(guī)雜峰。另外，在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)溶劑和流動(dòng)相中雜質(zhì)濃集效應(yīng)（低淋洗強(qiáng)度時(shí)吸附，高淋洗強(qiáng)度時(shí)洗脫出來(lái)）也屬此類。

          （4）基線不穩(wěn)  強(qiáng)保留雜質(zhì)的慢解吸基線不斷提高。 有時(shí)檢測(cè)器和電路系統(tǒng)的不穩(wěn)定也會(huì)引起基線的不穩(wěn)。

          （5）倒峰   當(dāng)柱子中有吸光度比流動(dòng)相低的溶劑或低（無(wú)）光吸光性物質(zhì)流出是，因光吸收值低于流動(dòng)相，會(huì)表現(xiàn)為倒峰。

          4.  “烷基配基坍塌”現(xiàn)象

           在使用高比例水為流動(dòng)相時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)所謂“烷基配基坍塌”的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，主要是由于隨著流動(dòng)相中水比例的增高，流動(dòng)相與硅膠的接觸角迅速增大，導(dǎo)致流動(dòng)相難以進(jìn)入填料硅膠的細(xì)小孔中，也不能浸潤(rùn)孔內(nèi)表面所致。這樣必然會(huì)造成溶質(zhì)在兩項(xiàng)中分布情況的改變，產(chǎn)生保留時(shí)間減少、柱效降低、峰形變壞以及峰的拖尾等問(wèn)題。

杭州森尼歐提供液相色譜儀色譜柱的選擇指南

　　現(xiàn)代液相色譜儀色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。
一、硅膠基質(zhì)填料：
1、正相色譜
　　正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其它具有極性官能團(tuán),如胺基團(tuán)（NH2,APS）和氰基團(tuán)（CN,CPS）的鍵合相填料。
　　由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其它極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組份的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。
　　正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正己烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
　　反相色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。
　　樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組份zui先被沖洗出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
　　常用的反相填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
　　 聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在pH值為1～14均可使用。
　　相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。
　　現(xiàn)有的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
三、其它無(wú)機(jī)填料
　　其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途。如，石墨化碳正逐漸成為反相色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體,又由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解, 這類柱可在任何pH與溫度下使用。 氧化鋁也可用于HPLC,氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在pH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型氧化鋯基質(zhì)色譜填料也可用于HPLC,商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用pH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。
　　當(dāng)然和氣相色譜的原理一樣，液相色譜的柱長(zhǎng)度，柱內(nèi)徑對(duì)分離效果也有重要的影響。
　　您現(xiàn)在就可以看到其實(shí)液相色譜柱的分離效果主要取決于其色譜填料，柱長(zhǎng)度，柱內(nèi)徑這幾個(gè)因素，從原理上講，這幾個(gè)因素相同的柱子，其分離效果是完全一樣的。
　　考慮到這一點(diǎn)，現(xiàn)在您完全根據(jù)這個(gè)更加本質(zhì)的依據(jù)來(lái)現(xiàn)在您的液相色譜柱，而不必一定去現(xiàn)在昂貴的標(biāo)準(zhǔn)指定液相色譜柱。