高效液相色譜儀脫氣常用方法
在食品分析中，無論是殘留分析還是成分分析，HPLC 也已成為不可或缺的分析儀器。流動相脫氣是HPLC 系統(tǒng)能得到可靠數(shù)據(jù)的一個很有效的措施。下面分析一下，高效液相色譜脫氣的必要性，并總結(jié)歸納了脫氣常用的方法。
一、脫氣的必要性
流動相脫氣是HPLC 系統(tǒng)能得到可靠數(shù)據(jù)的一個很有效的措施。HPLC 泵在輸送液體時要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當氣泡存在時，我們發(fā)現(xiàn)瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。如果這個氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預先設(shè)定的壓力低限，泵將停止工作。當一個氣泡通過輸液泵時，由于系統(tǒng)壓力大，氣泡通常會溶解在流動相溶液中，隨流動相通過柱子。但是到達檢測器流通池時系統(tǒng)壓力又恢復到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。
二、脫氣方法
1. 吹氦脫氣法。
利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa 壓力下，以約60 mL/min 流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L 氦氣通過1L 流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但氦氣價格較高，很少使用。
2. 加熱回流法。
此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。
3. 抽真空脫氣法。
此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa ，即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實驗的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。
4. 超聲波脫氣法。
將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗機中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果最差。
5. 在線脫氣法。
HPLC 儀器可配在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。
為了保證高效液相色譜結(jié)果的準確性，脫氣是一個當要的環(huán)節(jié)。
三聚氰胺即蜜胺，又稱氰尿酰胺，是一種白色晶體，含氮量高達66.7%，在食品和飼料中添加三聚氰胺，可以提高含氮量，冒充成高蛋白食品，從而大幅度降低成本。目前，測定粗蛋白的含量常用凱氏定氮法，而凱氏定氮法只能測出含氮量而無法測出氮的來源。從而造成如2007年美國寵物食品污染事件和2008年中國毒奶粉事件等嚴重的食物安全事故。調(diào)查顯示，不法商販在漁用飼料原料魚粉中添加三聚氰胺，以次充好謀求利潤，一旦用此類原料制造出來的飼料，必然可以檢出三聚氰胺，但含量均不高。
農(nóng)業(yè)部已命令禁止在飼料中人為添加三聚氰胺。2009年6月8日起農(nóng)業(yè)部發(fā)布第1218號公告，將飼料原料和飼料產(chǎn)品中三聚氰胺限量值定為2.5mg/kg。目前飼料中三聚氰胺殘留的檢測方法主要是氣相色譜法、液相色譜法和質(zhì)譜法。國內(nèi)標準NY/T 1372-2007《飼料中三聚氰胺的測定》中采用液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法檢測飼料中的三聚氰胺含量，檢測限分別達到2和0.05mg/kg?？紤]到由于質(zhì)譜法檢測設(shè)備昂貴，色譜法更具普及性。由于漁用飼料中三聚氰胺的含量不公開，且飼料中的雜質(zhì)成分復雜，所以要求檢測方法有更高的靈敏度和更好的穩(wěn)定性。根據(jù)國家對于飼料中三聚氰胺的限量要求，研究采用離子交換分離柱-液相色譜法測定漁用飼料中的三聚氰胺的方法，該方法簡便，重現(xiàn)性好，結(jié)果準確可靠。
儀器準備
儀器簡介
LC-600A智能全控液相色譜系統(tǒng)由P600高壓恒流泵與UV600紫外檢測器直接構(gòu)成等度分析系統(tǒng)。使用WS600工作站可以同時控制數(shù)臺P600高壓恒流泵、UV600紫外檢測器及恒溫柱箱等，實行多元高壓洗脫、波長掃描等功能。
應(yīng)用領(lǐng)域
化合物檢測、法醫(yī)毒物分析、蛋白質(zhì)組學食品檢測、藥物分析、環(huán)境分析、聚合物分析
色譜條件：
色譜柱 | 陽離子交換柱（SCX）， 250mm×4.6mm （內(nèi)徑），粒度5μm |
流動相 | 磷酸二氫鉀（50mmol/LpH=4.6）+乙腈=70:30 |
流速 | 1mL/min |
檢測波長 | 240nm |
柱溫 | 35℃ |
進樣量 | 20μL |
譜圖分析：
故障現(xiàn)象：
峰展寬
可能的原因：
(1)進樣體積過大
(2) 柱外體積過大
(3) 流動相粘度過高
(4) 保留時間過長
(5)樣品超載
(6)緩沖液溶度太低
(7)保護柱污染或失效
(8)色譜柱污染或失效，柱效太低
(9)呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的峰
(10)柱溫過低
YL9100液相色譜儀
排除方法：
(1)減小進樣體積
(2)檢查各接頭處的連接，避免死體積形成
(3)增加柱溫，采用低粘度流動相
(4)等度洗脫時增加強溶劑濃度，或采用梯度洗脫
(5)稀釋樣品，或采用小體積進樣
(6)增加濃度
(7)更換保護柱
(8)清洗或更換色譜柱
(9)選擇其他色譜柱改善分離效果
(10)適當提高柱溫
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