反相液相色譜柱具有無與倫比的性能。即使對于非常難分離的堿性化合物,也可獲得出色的峰形,從而改善了這些類型的樣品的柱效和分離度。
反相液相色譜柱使用中的注意事項
1、新C18柱在使用前,須先用甲醇或乙腈試劑以20倍柱體積低流速沖洗,作用是使固定相能充分潤濕、碳鏈舒展徹底,使反相液相色譜柱的性能達到更好狀態(tài)。
具體操作是,將配制好65%的乙腈/水沖洗后,把色譜柱進口端連接在色譜儀上,出口端放空(不可連上檢測器,以免污染了檢測器),以0.1ml/min~0.5ml/min的低流速將色譜柱中的清稀溶液吹干,過20分鐘后再接上檢測器,以1.0ml/min的流速,繼續(xù)沖洗2~8小時;
2、液相色譜儀檢測分析樣品完畢后,須沖洗色譜柱。尤其是流動相中含有酸或鹽時,需將色譜柱中的酸或鹽沖洗干凈,通常建議用10%甲醇水沖洗20倍柱體積;
3、若反相液相色譜柱處于長期閑置狀態(tài)時,要將色譜柱徹底沖洗,建議沖洗3-4小時以上,保存在純有機試劑或高比例的有機試劑溶液中;
4、由于C18柱的固定相疏水性較強,在使用過程中盡量不要使用高水相條件,若水相比例過高易引起固定相疏水塌陷,引起柱效迅速下降,甚至造成不可逆的負面影響;由于碳載量高,表現(xiàn)尤為明顯,建議使用過程中水相比例不超過90%;
5、壓力升高、柱性能下降:通常為色譜柱被污染,對色譜柱進行再生處理可恢復部分柱效;
6、壓力驟升:通常由鹽析出或篩板堵塞引起,若是鹽析出,用10%甲醇水低流速沖洗至壓力恢復即可;若判斷并非鹽析出,以純甲醇或10%甲醇水為流動相反沖色譜柱(將色譜柱反接,不接檢測器),若反沖半小時仍無效果則說明反沖無效,需尋找其他原因。
在硅膠制造和鍵合技術(shù)方面進行了改進,因此能夠獲得這樣優(yōu)異的性能,并且這些技術(shù)完全由控制。
在日常分析工作中,色譜柱的正確使用和維護十分重要,色譜柱使用是否得當,直接影響色譜柱的壽命,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱。
1、柱子在裝卸、更換時,動作要輕,接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動,以免柱床產(chǎn)生空隙。
2、如果儀器用來做常規(guī)分析,樣品種類不多,但分析次數(shù)比較多,則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱,這樣有助于延長柱子的壽命。
3、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會對柱內(nèi)填料產(chǎn)生沖擊力,因此在調(diào)節(jié)流速時應該緩慢進行,手動進樣時,進樣閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
4、應逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?/p>
5、使用柱溫箱時,應注意在流動相進入色譜柱后才能開啟柱溫箱升溫。
6、一般說來色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
7、選擇使用適宜的流動相,以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱,分析柱是鍵合硅膠時,預柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
8、避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。
9、經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時,對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右。
10、保存色譜柱時應將柱內(nèi)充滿色譜級的乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置一個晚上或更長時間。
11、色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時應更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗;另一種可能是大分子進人柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
12、在完成分離分析工作之后,不應立即停機,需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗,一般30分鐘以上,以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
在液相色譜分離系統(tǒng)中,色譜填料選擇的正確與否會直接影響到專業(yè)的液相色譜柱分離物質(zhì)效果的好壞。由于液相色譜填料具有相當寬的選擇范圍,所以我們在購買液相色譜柱之前有必要對不同液相色譜填料進行一個簡單的認識和了解。
第一、正相色譜硅膠基質(zhì)填料。
正相色譜柱的固定相是由硅膠和其他具有極性官能團組成的鍵合相填料。其物質(zhì)分離特點是極性較弱組合最先被色譜柱沖洗出來。而且正相色譜所使用的流動相其極性要低于固定相,流動相通常使用正乙烷和二氯甲烷等。
第二、反相色譜硅膠基質(zhì)填料。
反向色譜柱的填料是以硅膠材料為主要物質(zhì),并與極性相對較弱的官能團組成的鍵合相。其物質(zhì)分離特點是極性較強組合最先被色譜柱沖洗出來,而極性弱的組分則會更強的保留在柱子上。反向色譜的流動相的極性相對較強,常配制有機緩沖液作為流動相。目前較為常用的反相色譜填料有C4(B)、C8(MOS)以及C18(ODS)等。
第三、聚合物填料。
這種聚合物的填料一般是由聚甲基丙酸酯或者聚苯乙烯-二乙烯基苯組成。其特點是這種色譜柱的酸堿度適用范圍相對較廣,且疏水性很強,但它的柱效相對于硅膠基質(zhì)的填料要低一些。一般將這種大孔的基質(zhì)填料用于蛋白質(zhì)的分離。
第四、其他無機填料。
如石墨化碳對于酸堿度和溫度沒用嚴格的限制范圍,一般可對一些幾何導構(gòu)體進行分離。此外還有氧化鋁以及氧化鋯等無機填料的應用。
總而言之,如果我們能夠全面系統(tǒng)的了解一下液相色譜柱填料的分類及特點,那么我們在選擇購買一流的色譜柱時就可以在一個相對較小的范圍內(nèi)順利找到自己所需要的產(chǎn)品。這樣我們就可以在節(jié)省選擇購買時間的同時,也能快速買到令自己滿意的色譜柱。
下一篇:恒溫水浴的操作使用及注意事項