紫外可見分光光度計對于我們來說熟悉卻也比較難讀懂理解的。
天天有人提起他的名字卻沒多少人知道他的工作原理。
下面我們來淺談一下。
光譜工作原理：
分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。
由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會相同；
因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線；
可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。
分光光度分析就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。
它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團的信息。可以用標(biāo)準(zhǔn)光圖譜再結(jié)合其它手段進行定性分析。
根據(jù)Lambert-Beer定律說明光的吸收與吸收層厚度成正比，比耳定律說明光的吸收與溶液濃度成正比；
如果同時考慮吸收層厚度和溶液濃度對光吸收率的影響，即得朗伯-比耳定律。
即A=εbc，(A為吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為液池厚度，c為溶液濃度)就可以對溶液進行定量分析。
將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。
若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)完全一致。
如果沒有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照進行比較。
這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測定條件要相同。
實驗證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強度也不同;
這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不同溶劑中氫鍵強度，以確定選擇哪一種溶劑。
紫外可見分光光度計的工作環(huán)境：
1）分光光度計安放在干燥的房間內(nèi)，使用溫度為5-35℃，相對濕度不超過85%
2）儀器應(yīng)放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，且避免強烈的震動或持續(xù)的震動
3）室內(nèi)照明不宜太強，且應(yīng)避免直射日光的照射
4）電扇不宜直接向儀器吹風(fēng)，以防止光源燈因發(fā)光不穩(wěn)定而影響儀器的正常使用
5）盡量遠離高強度的磁場、電場及發(fā)生高頻波的電氣設(shè)備
6）避免在有硫化氫等腐蝕性氣體的場所使用
紫外可見分光光度計引用新型技術(shù)，其功能強大，采用單色器技術(shù)，波長范圍190-1100nm，是各種涉及水和廢水分析領(lǐng)域的通用儀器，應(yīng)用范圍包括市政和工業(yè)廢水，飲用水，加工過程用水，地表水，冷卻水和鍋爐補給水等。
紫外可見分光光度計應(yīng)用：
在水和廢水監(jiān)測中的應(yīng)用，對于一個水系的監(jiān)測分析和綜合評價，一般包括水相（溶液本身）、固相（懸浮物、底質(zhì)）、生物相（水生生物）。在水質(zhì)的常規(guī)監(jiān)測中，紫外可見分光光度法占有較大的比重。由于水和廢水的成分復(fù)雜多變，待測物的濃度和干擾物的濃度差別很大，在具體分析時必須選擇好分析方法。
在農(nóng)產(chǎn)品和食品分析中可用于檢測的組分或成分有蛋白質(zhì)、賴氨酸、葡萄糖、維生素C、硝酸鹽、亞硝酸鹽、砷、汞等;
在植物生化分析中可用于檢測葉綠素、全氮和酶的活力等；
在飼料分析中可用于檢測煙酸、棉酚、磷化氫和甲酯等。
紫外可見分光光度計維護要點：
一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降;造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正。應(yīng)具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設(shè)備，特別是地處南方地區(qū)的實驗室。
二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體也會影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵等。
三、儀器使用一定周期后，內(nèi)部會積累一定量的塵埃，建議由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進行除塵工作，同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進行清潔，必要時對光路進行校準(zhǔn)，對機械部分進行清潔和必要的潤滑，最后，恢復(fù)原狀，再進行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。
目前,紫外可見分光光度計的應(yīng)用主要是在定量分析方面。先從生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用來介紹。紫外可見分光光度計在生命科學(xué)中應(yīng)用非常廣泛。最主要的是以下5個方面。
1.蛋白質(zhì)分析工作中
紫外可見分光光度計在蛋白質(zhì)的分析中,最主要的是作蛋白質(zhì)含量檢測;一般是在蛋白質(zhì)的吸收峰上作吸光度測定。因為蛋白質(zhì)對紫外光的主要吸收波長為280nm,所以,采用光度測量模式,將儀器的波長GOTO到蛋白質(zhì)的最大吸收峰波長280nm上,測試其吸光度大小,就可完成對蛋白質(zhì)的定量檢測。
2.核酸分析工作中
紫外可見分光光度計在核酸分析中的應(yīng)用,主要是用來對核酸的定量檢測;因為核酸的吸收峰在260nm。我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計的波長GOTO到核酸的最大吸收峰260nm上,測試其吸光度大小就是了。
3.氨基酸分析工作中
紫外可見分光光度計在氨基酸分析中的應(yīng)用,主要是用來對氨基酸的定量檢測。因為氨基酸對紫外光的主要吸收波長為230nm,所以,我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的最大吸收峰230nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出氨基酸的含量。但是,因為氨基酸分析時,一般是將它溶解在水中,而水在230nm附近有很多干擾吸收線,所以,在用紫外可見分光光度計對氨基酸分析檢測時,要注意防止干擾的問題。此外,還需注意:只有少數(shù)氨基酸有紫外吸收,多數(shù)氨基酸無紫外吸收或很弱,測定時要衍生化后再測。
4.糖類分析測試工作中
紫外可見分光光度計在糖的分析中,主要是作定量檢測。因為糖對紫外光的主要吸收波長為218nm,所以,對糖類進行分析時,只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的最大吸收峰218nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出糖的含量。
5.多糖分析測試工作中
紫外可見分光光度計在多糖的分析中,主要也是作定量檢測。因為多糖對紫外光的主要吸收波長為206nm,所以,我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到多糖的最大吸收峰206nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出多糖的含量。
但是多糖的分析難度很大。因為,在206nm處的時候,光源(氘燈)的能量已經(jīng)很弱,儀器光學(xué)系統(tǒng)的能量輸出也很低,光電倍增管的靈敏度也很低,206nm左右的干擾也很大。所以,用紫外可見分光光度計作多糖的分析是很難的事,目前許多科學(xué)家正在研究中。
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