高效液相色譜儀適宜于分離、分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領(lǐng)域中針對這種精密而又運用廣泛的科學儀器。
下面我們來聊一聊基線。HPLC常見的基線問題主要有基線漂移以及基線噪音。
基線漂移
線漂移基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題。一般說來，機器剛起動時，基線容易漂移，大概要30min的平衡時間，如果用了緩沖溶液、緩沖鹽，或者在低波長下(220nm)平衡時間相對會比較長，仍然發(fā)現(xiàn)基線漂移，原因可能有以下幾種：
1、柱溫波動
控制好柱子和流動相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。
2、流通池被污染或有氣體
用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池(盡量斷開柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。
3、紫外燈能量不足
更換新的紫外燈
4、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。檢查流動相的組成，使用高品質(zhì)的化學試劑及HPLC級的溶劑。
基線噪音
對于紫外檢測器,氘燈光源打開后要預熱30min以上,基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測物無關(guān)的檢測器輸出信號的隨機擾動變化,分短期噪聲和長期噪聲兩種。
基線噪音(規(guī)則的)
產(chǎn)生基線噪音的原因有：在流動相、檢測器或泵中有空氣;漏液;流動相混合不完全;溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱);在同一條線上有其他電子設(shè)備;泵振動。
了避免基線噪音,在正式進樣之前,需要對流動相脫氣;沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣;檢查管路接頭是否松動;泵是否漏液;是否有鹽析出和不正常的噪音,如有必要,更換泵密封;用手搖動使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器;有其他電子設(shè)備時斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正;泵振動時在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。
基線噪音(不規(guī)則的)
(1)漏液：檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封,檢查流通池是否漏液。
(2)流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成：檢查流動相的組成。
(3)流動相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動相。
(4)檢測器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。
(5)系統(tǒng)內(nèi)有氣泡：用強極性溶液清洗系統(tǒng);檢測器內(nèi)有氣泡,清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。
(6)流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音):用硝酸清洗流通池;
(7)檢測器燈能量時不足更換燈;
(8)色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。
(9)流動相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,不建議使用泵的混合裝置。
高效液相色譜儀操作步驟如下：
1)過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜.
2)對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)打開hplc工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。
4)進入hplc控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。
6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。
7)設(shè)計走樣方法。
8)進樣和進樣后操作。
9)關(guān)機時，先關(guān)計算機，再關(guān)液相色譜。
10)填寫登記本，由負責人簽字。
11)流動相均需色譜純度，水用20m的去離子水。
12)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
13)所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
14)壓力不能太大，可以不要超過2000psi。
高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。
色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合色譜及質(zhì)譜的技術(shù)，是目前分離和鑒定的重要的分析方法之一。
其中液相色譜-質(zhì)譜儀應用更為廣泛，液相色譜除了能分析一般的化合物，還能分析氣相色譜不能分析的強極性、熱不穩(wěn)定性、難揮發(fā)的化合物。
液相色譜質(zhì)譜儀由色譜儀、接口、質(zhì)譜儀、電子系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)六大部分組成，是一種高端的檢測儀器，儀器的良好工作狀態(tài)是檢測準確度的一個重要影響因子。
為了保證儀器有一個良好的狀態(tài)，保證檢測結(jié)果的可靠性，需要正確合理的使用和維護儀器。
下面以質(zhì)譜儀為例，從儀器進樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、質(zhì)譜系統(tǒng)等各個系統(tǒng)的日常維護保養(yǎng)進行詳細闡述；
并對使用過程中容易遇到的問題進行分析，提出解決方法。
液相部分的維護
開機注意事項
要求使用220V單相交流電。如發(fā)生斷電，不管任何原因造成的，首先關(guān)閉儀器面板左下角的開關(guān)，等待供電恢復10分鐘以上再開啟電源，否則有可能燒毀電路板。
儀器運行時需提供純度>99%的氮氣作為噴霧與干燥氣，輸出壓力為0.6～0.7MPa。
實驗開始前先檢查液氮罐液體存量是否充足。
儀器開機時，確認電源已經(jīng)連接而且氣振閥處于關(guān)閉，打開儀器總電源，隨后將前面板左下方的電源按鍵按下，真空泵即開始工作。
大約2～3分鐘后，儀器內(nèi)置的系統(tǒng)啟動完畢，可以開啟Mass hunter軟件與儀器通訊。
等待四極桿溫度達到100℃，高真空達到4×10-5Torr之后，即可進行調(diào)諧或開始實驗。
在儀器開始抽真空時，請不要打開前級泵上的氣振閥，否則可能因為回油污染真空腔體內(nèi)部。
流動相的要求
每次開機前，保證超純水和流動相的新鮮，泵的各個管路不應余留上次殘留的溶劑。
流動相需符合HPLC與LC-MS要求等級，流動相中盡量加易揮發(fā)的鹽，盡量不使用表面活性劑之類；
否則容易導致離子抑制，表面活性劑產(chǎn)生的加合物和離子簇會干擾質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
如果遇到離子抑制，可以把樣品峰往后推或者改變提取方法，或者考慮用APCI源。
盡量不使用無揮發(fā)性的緩沖劑，例如，磷酸緩沖劑等，磷酸鹽及其他不揮發(fā)緩沖鹽在離子源會沉淀并堵塞毛細管等。
另外液質(zhì)不能承受過大流速。溶劑瓶避免陽光直射。
樣品的要求
保證樣品的清潔，進樣前盡量使用0.22m的濾膜濾過，避免樣品太臟而堵塞色譜柱或離子源的毛細管;
樣品溶劑必須是色譜純，應該和流動相比例一致;進樣濃度不宜太高，因為太高濃度的樣品容易污染靈敏度高的儀器，進而影響檢驗結(jié)果。
由于液質(zhì)的流速較小(ESI一般為0.2mL/min)，所以配置樣品的溶劑強度不能太大；
盡量小于起始比例，否則，會出現(xiàn)保留時間偏移、峰形扭曲等問題。
進樣系統(tǒng)的維護
對于液相色譜來說，無論是手動進樣還是自動進樣，都是使用六通閥進樣的。
進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小樣。
六通閥使用及維護注意事項：
①樣品溶液進樣前必須用0.45m濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。
②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增；
甚至超過泵的限值壓力;再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。
③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結(jié)束后應沖洗進樣閥。
通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
注意：溶劑入口過濾芯為消耗品，尤其不可以使用超聲清洗，可以使用稀硝酸浸泡，然后用水沖洗至中性，以重復使用。
色譜柱系統(tǒng)的維護
在色譜操作過程中，需要注意下列問題：
①色譜柱的選擇會直接影響混合物中組分的分離，所以一定要選用合適的色譜柱，在使用新柱前要在自己的液相色譜儀上進行性能測試，即使用色譜柱附帶的檢驗報告上測試條件和樣品來測定該色譜柱的柱效，并且在以后的使用中，應時常對色譜柱進行測試。
②柱子在使用過程中，不能碰撞、彎曲或強烈震動;避免壓力和溫度的急劇變化，機械震動和溫度的突然變化都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應該緩慢進行。
③當柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈，樣品前處理對于柱子使用壽命影響甚大，進樣樣品要提純過濾并且嚴格控制進樣量，可以使用保護柱。
④注意色譜柱的pH值使用范圍，不能高溫下過長時間使用硅膠鍵和相;每天分析工作結(jié)束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?。若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉。
質(zhì)譜部分的維護
質(zhì)譜部分的維護一般可以按照以下日程進行：
每天沖洗樣品通路、清潔噴霧式;每周檢查粗真空泵油的液面;更換粗真空泵油，檢查軟管、軟線和電纜；
清空排污瓶可以每半年進行一次;另外在日常的試驗中，根據(jù)試驗需要清潔機殼，更換噴霧針，清潔或更換整個毛細管、分離器及透鏡。
重要的是每天沖洗系統(tǒng)和清潔噴霧室。毛細管和第一級錐孔要盡可能潔凈。
6個月更換機械泵油，需要時更換電子倍增器。
錐孔的清潔維護
定期清洗一級錐孔，一般兩周清洗一次，若進樣數(shù)量較大，則盡量一周清洗一次，根據(jù)樣品數(shù)量多少及時清洗。
清洗時將離子源溫度降到室溫，注意關(guān)閉阻斷閥，旋開固定錐孔的兩個螺絲，取下錐孔滴甲酸數(shù)滴，浸潤幾分鐘，在甲醇：
水為50:50溶劑中超聲清洗15分鐘，切記：避免手觸碰到錐孔尖以免影響靈敏度。
長期進行一級錐孔的清洗，可相應減少較為復雜的二級錐孔、六級桿等的清洗，這些清洗相對復雜；
在進行相關(guān)部件清洗時避免用棉花等擦拭關(guān)鍵部位，避免殘留的毛絨纖維干擾儀器的靈敏度。
粗真空泵的維護
真空泵包括需油的回轉(zhuǎn)泵及無油的渦旋泵，真空泵需注意觀察潤滑油是否出現(xiàn)渾濁或缺油的情況，及時更換潤滑油。
泵的油面宜在2/3處，泵長期運作時每周需要擰開灰色震氣閥按鈕進行半小時震氣，使油內(nèi)的雜物排出，油霧過濾器中的油放回到泵中；
然后再擰緊該旋鈕，如果發(fā)現(xiàn)油的顏色變深或液面降至1/2以下，需及時更換并保存更換記錄，注意專油專用;
無油渦旋泵，也需定期維護，一般半年到一年時更換葉端密封，每天需要震氣。
其他附屬設(shè)備維護
①每天實驗完成之后，使用1:1異丙醇—水溶液清洗或擦洗離子源。注意清洗離子源時請勿將溶液噴入毛細管入口。
②當電噴霧噴針被堵塞，針尖破損或觀察到偏離軸的噴射時，就需要更換或調(diào)整。
③檢查毛細管，鉑金涂層變透明時需要更換，注意檢查毛細管時需要放真空，毛細管兩端的鉑金涂層不能用砂紙打磨。
④數(shù)據(jù)系統(tǒng)，需定期備份硬盤數(shù)據(jù)，進行歸類整理。定期重新啟動機器，將內(nèi)存區(qū)域?qū)腴W存，保證數(shù)據(jù)系統(tǒng)的穩(wěn)定。
質(zhì)譜儀的校準工作，一般宜6個月校準一次。注意短時間內(nèi)溫度的急劇變化，其會影響質(zhì)量軸的偏離。
常見色譜故障
壓力過高
壓力過高的原因有很多，但總體來講就是一個原因，管路堵塞。
所以當出現(xiàn)壓力高時候就要分段來檢查哪一段發(fā)生堵塞，檢查柱子進口過濾芯是否被污染；
PURGE閥過濾芯是否被污染或色譜柱被污染，檢查管路，尤其是針座毛細管，檢查進樣器旋轉(zhuǎn)密封閥或者進樣針及針座有否堵塞。
壓力過低
壓力過低總體來講一個原因就是漏液問題，可能是管路泄露或者泵頭密封墊老化；
主動閥、四元出口閥或單向出口閥失靈，另外還要考慮是否色譜柱失效造成固定相流失、溶劑或者流速的改變等因素。
注意壓力傳感器之前的某些部件地方堵塞也會造成壓力過低。
壓力波動
液相泵的壓力波動可以從ripple值看出，1200/1260一般ripple值小于2%。
如果液相泵的壓力不穩(wěn)定，會影響質(zhì)譜TIC基線的穩(wěn)定，并呈規(guī)律性變化。造成壓力波動常見的原因就是泵內(nèi)有氣泡。
綜上所述，使用液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用儀器的工作人員，在熟練掌握儀器操作基礎(chǔ)上；
應了解各個組成部分的性能，在日常使用中累積經(jīng)驗，從小處著手做好日常維護保養(yǎng)工作。
如此，才能保證儀器的良好狀態(tài)，很大程度降低使用維護成本；
確保分析結(jié)果的準確可靠性，并能降低儀器耗損率，延長使用壽命。
高效液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1.進樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4X107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個基團的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000?)和比表面積大的特點，加之其表面經(jīng)過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
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