高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4、9~107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。
特點(diǎn)
1、高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150～350×105Pa。
2、高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。
3、高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4、高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。
5、適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣虼瞬皇茉嚇訐]發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于400以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱進(jìn)口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。
進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。
1.隔膜進(jìn)樣。
用微量注射器將樣品注進(jìn)專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎即是零，可以獲得較佳的柱效，且價(jià)格便宜，操縱方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜輕易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進(jìn)樣。
可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”;另一缺點(diǎn)是保存時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3.閥進(jìn)樣。
一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥(以美國(guó)Rheodyne公司的7725和7725i型常見)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進(jìn)樣量正確，重復(fù)性好(0.5%)，操縱方便。
4.自動(dòng)進(jìn)樣。
用于大量樣品的常規(guī)分析。
液相色譜儀的應(yīng)用，可用于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差以及具有生理活性物質(zhì)的分析。一般來說，沸點(diǎn)在450℃以下，相對(duì)分子質(zhì)量小于450的有機(jī)物可用液相色譜儀分析，但這些物質(zhì)只占有機(jī)物的15%～20%，其余的80%～85%有機(jī)物原則上都可采用高效液相色譜儀分析。
色譜柱的使用和維護(hù)，色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。調(diào)節(jié)流速太快，避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。
反沖色譜柱，一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效，預(yù)柱和保護(hù)柱，選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。
有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)，由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。
工作原理，利用混合物各組分在固定相和流動(dòng)相中溶解、分配或吸附等化學(xué)作用性能的差異，使各組分在作相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離。
從液相色譜儀工作流程中看到，色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。
色譜填料：經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。
色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。
色譜柱：也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的，色譜柱的填充，干法填充：在硬臺(tái)面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺(tái)面墩10-20次。
濕法填充：又稱淤漿填充法，使用專門的填充裝置。
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