酶標(biāo)儀在臨床實(shí)驗(yàn)方面應(yīng)用廣泛，用于鑒別乙肝兩對(duì)半，HIV，鑒定DNA等許多方面，可以說(shuō)它是臨床及醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)不可或缺的基礎(chǔ)設(shè)備。
故障一：測(cè)量的結(jié)果重現(xiàn)性不好，即使用空板測(cè)量誤差也在允許的范圍之外。
故障分析：檢查試劑發(fā)現(xiàn)沒(méi)有問(wèn)題，檢查判定公式也沒(méi)有問(wèn)題，檢查光路也沒(méi)有污染。幾經(jīng)周折終于發(fā)現(xiàn)卡微板的卡簧在伸縮后沒(méi)有卡到位，造成微板在測(cè)量時(shí)在機(jī)內(nèi)晃動(dòng)影響測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)。
故障二：測(cè)量結(jié)果OD值偏低。
故障分析：排除完燈的能量值偏低后，檢查發(fā)現(xiàn)濾光片上有灰塵，用蒸餾水和擦鏡紙擦洗干凈晾干后故障排除。
測(cè)試方法：酶標(biāo)儀的儀器指標(biāo)在蕞佳狀態(tài)，就儀器的精度測(cè)試和儀器的線性度介紹幾種測(cè)試方法。
精度測(cè)試：該過(guò)程可被用于檢測(cè)不同微板之間的測(cè)量精度。
使用新制備的在0.1％ TWEEN20中的橘黃色甲基填充微孔，在每個(gè)微孔中使用不同稀釋度的溶劑以便獲得一個(gè)光密度范圍，首先確保每孔注入200mL液體，使用492nm慮光片測(cè)量至少3次，對(duì)每一微孔進(jìn)行下列計(jì)算：
(1)平均OD值；(2)蕞高和蕞低值；(3)平均值。蕞高和蕞低值之間的差值和百分比。讀數(shù)范圍在0．000到2．000Abs。同一孔平均值，蕞高值和蕞低值之間的差值應(yīng)該在+／一1．0％和+／一0．010OD范圍內(nèi)。
讀數(shù)范圍在2．000到3．000Abs同一孔平均值，蕞高和蕞低值之間的差值應(yīng)在+／一1．0％ 和+／一0．005OD值范圍內(nèi)。讀數(shù)范圍在3．000Abs以上時(shí)準(zhǔn)確度不符合要求。
酶標(biāo)儀儀器線性度：儀器的線性度可使用一種溶劑的稀釋系列得到。如可在492 nIn處測(cè)量在0．1％TWEEN20中的橘黃色甲基的稀釋系列。
具體方法如下：在參考光密度計(jì)上測(cè)量被稀釋的溶劑，畫(huà)出OD值對(duì)已知濃度的點(diǎn)圖，并畫(huà)出通過(guò)這些點(diǎn)的蕞好的直線。將從系列稀釋中測(cè)得的吸光度值與該圖比較從而計(jì)算出各稀釋度的濃度。微板中每種稀釋度加入250t,-L，對(duì)每種稀釋至少使用兩個(gè)樣本，以便降低因加樣引起的誤差。 測(cè)量微板使用精確測(cè)量模式，利用測(cè)量得到的平均OD值和每個(gè)樣本的已知濃度畫(huà)一條OD濃度的曲線，從系列稀釋中測(cè)得的吸光值與該曲線比較從而計(jì)算出各稀釋度的濃度。
對(duì)光度記和本儀器，比較計(jì)算的濃度，不準(zhǔn)確度不應(yīng)大于以下，使用標(biāo)準(zhǔn)濾光片492nm時(shí)吸光度在0．000～2．000Abs+／一1％、2．000～3．000Abs+／一1．5％。使用梯度濾光片492nm時(shí)，吸光度在0．000～2．500Abs+／一2％。
面對(duì)類型如此眾多的酶標(biāo)儀，實(shí)驗(yàn)室在選擇時(shí)往往有難以適從的感覺(jué)。
一般來(lái)說(shuō)，用于酶免疫測(cè)定比色的酶標(biāo)儀可分為普通酶標(biāo)儀，多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀和全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)等，普通酶標(biāo)儀的功能基本上相當(dāng)于一個(gè)微孔板比色計(jì)，而多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀除了有微孔板比色功能外，還有酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)，紫外乃至凝集等多種檢測(cè)功能;全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)則有試劑“開(kāi)放”和“限定”之分，所謂試劑“開(kāi)放”是指不同品牌的ELISA試劑均可用于該儀器，而試劑“限定”則必須使用儀器專用的酶免測(cè)定試劑。
實(shí)驗(yàn)室在選擇酶標(biāo)儀時(shí)，一般應(yīng)遵循這樣幾條原則：
1.根據(jù)工作需要去選擇
切忌刻意去求功能多，因?yàn)橐粍t如果儀器功能過(guò)多，易出故障，二則有些功能如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)或凝集等，可能根本就用不上;如果擬購(gòu)置的酶標(biāo)儀主要是用于定性測(cè)定，則不必要求完美的定量所需的軟件系統(tǒng)。至于全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)則對(duì)工作量比較大的血站或大型醫(yī)院較為適用，對(duì)于日常工作量不太大的實(shí)驗(yàn)室，就無(wú)必要。
2.根據(jù)酶標(biāo)儀的性能去選擇
反應(yīng)酶標(biāo)儀性能的指標(biāo)主要有測(cè)定波長(zhǎng)范圍，濾光片配置，檢測(cè)速度，吸光度范圍，線性范圍，分辨率，準(zhǔn)確度，精密度等。
3.根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的財(cái)力去選擇
酶標(biāo)儀品種類型多，由于性能不一，價(jià)格自然也就相差較大，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的財(cái)力去選擇性能/價(jià)格比較為合適的酶標(biāo)儀。
4.根據(jù)售后服務(wù)去選擇
實(shí)驗(yàn)室儀器買了以后，就跟我們家里使用的家用電器一樣，在使用過(guò)程中及使用一段時(shí)間之后，很可能就會(huì)有保修或維修方面的問(wèn)題，因此一定要選擇售后服務(wù)好的公司的酶標(biāo)儀。
5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室人員的外語(yǔ)水平去選擇
進(jìn)口酶標(biāo)儀現(xiàn)有不少已使用中文人機(jī)對(duì)話，對(duì)于英語(yǔ)上有困難的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)盡可能選用此類酶標(biāo)儀。
確定了選擇原則以后，就是怎樣去選擇了。選擇的步驟首先是要獲取有關(guān)酶標(biāo)儀的信息資料，一般有這樣幾條途徑：
?、傧蛞奄?gòu)不同酶標(biāo)儀的多家實(shí)驗(yàn)室同行咨詢?cè)L問(wèn)，獲取最直接的使用效果的信息;
?、诿笜?biāo)儀銷售商的信息廣告及介紹;
?、蹤?quán)威機(jī)構(gòu)的儀器評(píng)估報(bào)告。
獲取了盡可能多的酶標(biāo)儀信息資料后，就是對(duì)不同類型的酶標(biāo)儀的性能指標(biāo)進(jìn)行比較，選擇較為適合本實(shí)驗(yàn)室的一種或二，三種再向銷售商作進(jìn)一步的詳細(xì)咨詢了解，以決定選擇哪一種進(jìn)行自檢。
酶標(biāo)儀其基本功能不外乎一個(gè)比色測(cè)定，所不同的是在測(cè)定波長(zhǎng)范圍、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)速度、震板功能、溫度控制、定性和定量測(cè)定軟件功能等方面的差異，當(dāng)然全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)還具有自動(dòng)洗板、溫育、加樣等功能。在臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作中，實(shí)驗(yàn)人員在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定操作時(shí)，有時(shí)難免會(huì)對(duì)酶標(biāo)儀的一些性能指標(biāo)產(chǎn)生迷惑，甚至對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用產(chǎn)生錯(cuò)誤的理解。
一、測(cè)定波長(zhǎng)
目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過(guò)氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(zhǎng)處有最大吸收，當(dāng)pH值降為L(zhǎng)0時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)移至492nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過(guò)量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此，450nm和492nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定常用的。酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂的“單波長(zhǎng)”就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而“雙波長(zhǎng)”則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長(zhǎng)如630nm進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀最后打印出來(lái)的吸光度則為二者之差。630nm波長(zhǎng)下得到的吸光度是非特異的，來(lái)自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測(cè)定中，可以使用雙波長(zhǎng)，且不必設(shè)空白孔。
二、測(cè)定的吸光度范圍
酶標(biāo)儀的吸光度測(cè)定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測(cè)定要求。早期的酶標(biāo)儀可測(cè)定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。
三、光學(xué)系統(tǒng)
酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道(通常為8或12通道，亦有單通道)檢測(cè)，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測(cè)定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道，每次測(cè)定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來(lái)。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測(cè)定的精密度與測(cè)定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。
四、檢測(cè)速度
酶標(biāo)儀的檢測(cè)速度是指其完成比色測(cè)定所需要的時(shí)間。檢測(cè)速度快，有利于提高檢測(cè)的精密度，即避免由于測(cè)定過(guò)程中，因測(cè)定時(shí)間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。
五、震板功能
酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對(duì)ELISA板孔進(jìn)行比色測(cè)定前對(duì)其進(jìn)行振蕩混勻，使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的酶標(biāo)儀均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié)。使用有震板功能的酶標(biāo)儀，在進(jìn)行ELISA測(cè)定顯色反應(yīng)完成加入終止劑后，可不必振蕩混勻，直接放人酶標(biāo)儀上測(cè)定即可。
六、溫育功能
溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動(dòng)精確地控制儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測(cè)定中微孔板條的溫育過(guò)程可在儀器內(nèi)部完成，而無(wú)需再外配溫箱。目前，只有少部分酶標(biāo)儀具有此種功能。
七、軟件功能
軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對(duì)ELISA定性和定量測(cè)定及其他測(cè)定方式如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并報(bào)告結(jié)果的功能。軟件功能是中高檔酶標(biāo)儀的一個(gè)非常重要的功能。如果硬件方面區(qū)別不大，則軟件就成為判定酶標(biāo)儀優(yōu)劣的惟一指標(biāo)。對(duì)于用戶來(lái)說(shuō)，好的軟件功能，對(duì)實(shí)際工作會(huì)有較大的幫助。ELISA定性測(cè)定，酶標(biāo)儀如具有陽(yáng)性判斷值(cut-off)及其測(cè)定“灰區(qū)”(即指測(cè)定吸光度處于cut-off周圍的一定區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)結(jié)果應(yīng)為“可疑”)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算功能，不但方便了實(shí)驗(yàn)室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實(shí)用價(jià)值。有研究表明，四參數(shù)方程能較好地反映免疫測(cè)定的劑量反應(yīng)曲線，較為適合于定量酶免疫測(cè)定的曲線擬合。因此，如目的是定量測(cè)定，則在酶標(biāo)儀的軟件功能中，可以要有這種曲線回歸方程計(jì)算分析功能。其他諸如連點(diǎn)、直線等回歸計(jì)算，則可根據(jù)酶標(biāo)儀的應(yīng)用目的而定，如兼用于微量生化測(cè)定，則此類回歸計(jì)算就很有必要。
八、語(yǔ)言界面
通常進(jìn)口的中高檔酶標(biāo)儀人機(jī)對(duì)話多采用英文。這對(duì)于某些基層實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)存在語(yǔ)言方面的困難，從而難以最大限度地發(fā)揮酶標(biāo)儀的作用。為解決這方面的問(wèn)題，已有一些酶標(biāo)儀采用了中文界面。這樣就大大方便了廣大基層實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的使用。
綜上所述，盡管酶標(biāo)儀的發(fā)展極為快速，種類繁多，功能也不斷加強(qiáng)，但其最根本的功用是不變的，即比色測(cè)定。大凡比色測(cè)定，其基本要求就是在一定吸光度范圍內(nèi)要有好的測(cè)定準(zhǔn)確性、線性和精密性。同樣的吸光度范圍，測(cè)定的準(zhǔn)確性、線性和精密性越好則酶標(biāo)儀亦越佳。
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