色譜柱的利用壽命，除了與所分析的樣品和流動相及利用頻率有關(guān)系外，主要的是與日常的委會密切相關(guān)。為延長色譜柱的利用壽命，維護(hù)您的利益，請仔細(xì)閱讀此部分。 色譜柱的利用壽命主要是分局柱效和柱壓兩個指標(biāo)來衡量，假設(shè)一支色譜柱柱效太低或柱壓太高，通常被認(rèn)為該色譜柱已經(jīng)結(jié)束。因此，延長色譜柱利用壽命的關(guān)鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。
以下是色譜柱的日常維護(hù)點子：
1.流動相的PH應(yīng)在利用的范圍內(nèi)反相色譜柱由于填料中存在Si-C和Si-O鍵，流動相超過其PH范圍將會導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，利用壽命變短。由于流動相的PH 控制欠妥而對色譜柱造成的損害，通常很難是色譜柱恢復(fù)，因此必須認(rèn)真對待，嚴(yán)格控制流動相的PH值。
2.去除樣品和流動相中的固體顆粒 樣品和流動相中含有的固體顆粒物質(zhì)會堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會引起柱壓的升高，而且也會引起柱效下降，因為篩板的堵塞會引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議利用超純水和色譜純試劑，在分析樣品前對樣品進(jìn)行針筒過濾，流動相過0.45μm濾膜。
3.利用維護(hù)柱或在線過濾器 樣品和流動相經(jīng)過濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì)，因為泵的磨損、密封圈和管路的老化也會產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì)，這些固體顆粒被流動相帶入色譜柱，堵塞篩板，導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。維護(hù)柱和在線過濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此能夠阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對樣品和流動相進(jìn)行過濾外，建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上維護(hù)柱或在線過濾器。 假設(shè)確認(rèn)色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的，可選擇以下方式進(jìn)行補救：
先在色譜柱前加上維護(hù)柱或在線過濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min。
先在色譜柱進(jìn)樣端加上維護(hù)柱或在線過濾器，然后反向利用。
色譜柱參數(shù)
物理性質(zhì)
柱長，內(nèi)徑，如250*4.6mm。一般柱長在2—250mm，柱越長，分離度越高，但柱壓更高，分離所需時間更長;但分離度與理論塔板數(shù)的平方根成正比，所以一昧增加柱長并不是較為有效的分離手段，一般情況下，150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數(shù)。
粒徑，影響色譜分離度。粒徑越小，分離越快，柱效越高，但柱壓力越高，柱容易被污染，導(dǎo)致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料，復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑，更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍，因此如何選擇填料粒徑需要根據(jù)現(xiàn)實情況而定。
孔徑，60A，120A，300A等?？讖叫?，則含孔率高，比表面積大，載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配，保證分子自由進(jìn)出填料孔并與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配，通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。
顆粒形狀，一般有球形和不規(guī)則形，當(dāng)使用黏度較大的流動相時，球形顆?？梢越档椭鶋海娱L色譜柱壽命。
苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化學(xué)穩(wěn)定，應(yīng)用pH范圍寬，具有更強的疏水性，對蛋白質(zhì)等樣品分離效果較好;但強度較小，有機溶劑可能導(dǎo)致聚合物溶脹而受損，批次重復(fù)性較差，商品化色譜柱不多，一般價格較貴。
載碳量：基質(zhì)表面鍵合相的比例，載碳量高，則保留增加，適合分析非極性化合物。
鍵合相：鍵合試劑不同，對化合物的選擇性不同，一般長鏈的烷基鍵合相(C18 C8)比短鏈的(C4 C3)穩(wěn)定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩(wěn)定。
封端：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來，以減少殘留的硅醇基，減輕待測組分與酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象。尤其對于極性樣品而言，未封端處理的色譜柱分離效果較差。
現(xiàn)在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目，根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個初步的選擇，但由于各個儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數(shù)，仔細(xì)閱讀色譜柱說明書，才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。
反相色譜柱采用高純和高機械強度的硅膠，采用先進(jìn)的鍵合技術(shù)制備而成,色譜柱表面鍵合率高，覆蓋完全，對堿性和酸性化合物具有良好的峰形。
色譜柱柱容量高，壽命長，是一款具有較高性價比的色譜柱。
反相色譜柱性能優(yōu)點：
(1)在正相和反相中都能有應(yīng)用
(2)穩(wěn)定的高覆蓋率的單鍵合相，充分封端球型
(3)較低的疏水性，由于氰基的存在，具有獨特的選擇性
(4)與裸硅膠不同的選擇特性；與裸硅膠柱相比，色譜柱的平衡時間快。
反相色譜柱在使用緩沖液的過程中還要注意以下幾點：
a.避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用；
b.緩沖液zui好要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長時間實驗時會發(fā)生很多怪現(xiàn)象；
c.使用緩沖液要及時掌握pH范圍，做到胸中有數(shù)；
d.清洗液路和柱子時，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗；
e.長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，定期用10%硝酸沖洗液路可以避免液路的堵塞；
f.選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩；過渡流動相是指有機相和水相的組成與分析流動相相同，但是不含緩沖鹽的溶液。
反相色譜柱為色譜柱提供方便、經(jīng)濟(jì)和有效的保護(hù)，延長了色譜柱的壽命，保證分析結(jié)果的重現(xiàn)性。
隨著使用時間的增加，高效液相色譜柱分離效能下降，柱壓增高，其原因主要是由于色譜柱進(jìn)口段的少量填料被污染引起的，而色譜柱整個柱床并未被破壞，使用保護(hù)柱，相當(dāng)于在色譜柱前增加了一段額外的填料，起到了保護(hù)整個色譜柱的作用。
柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。
填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學(xué)、含碳量及烷基化處理。
(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個平均值。
如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實際上有一個顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。
一般來說，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。
(2)孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。
球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結(jié)構(gòu)均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結(jié)構(gòu)不均勻，流動相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)寬。
平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時可能會有分子排阻效應(yīng)，或產(chǎn)生吸附效應(yīng)從而影響定量的回收率及準(zhǔn)確度。
因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時應(yīng)考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料。
孔體積作為硅膠多孔性的參數(shù)，在分離分析較大分子化合物時可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。
(3)化學(xué)鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機基團(tuán)，采用極性較小的溶劑作流動相。
亦可鍵合極性較小的有機基團(tuán)，選用極性較大的溶劑作流動相。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應(yīng)目前應(yīng)用較為普遍。
如以十八烷基三氯硅烷與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應(yīng)生成烷基化學(xué)鍵合相，商品名為M-Bondapak-C18
(4)碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術(shù)是將填料加熱到碳?xì)滏I斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計算碳含量。
可以通過增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。
鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關(guān)，也與硅膠的密度及填料的表面積有關(guān)，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。
如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨以碳含量來預(yù)測色譜行為是不夠的。
(5)C18硅烷化試劑是一個大于2 nm大分子，因此會與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴(yán)重的立體位阻。
其結(jié)果導(dǎo)致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應(yīng)，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾，從而可影響定量分析結(jié)果。
這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨立反應(yīng)，以減少在硅膠表面的硅醇基。
烷基化處理采用小分子(如三甲硅烷)的試劑，其空間位阻遠(yuǎn)小于C18基團(tuán)。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。
據(jù)報道，通過某些極活躍的化學(xué)試劑及特殊的反應(yīng)條件，最高的覆蓋量可達(dá)50%。
很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在高效液相色譜的反應(yīng)中選擇合適的色譜柱。
表面上看C18柱雖然化學(xué)官能團(tuán)相同，而實際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別，從而產(chǎn)生不同的分離結(jié)果。
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