高效液相色譜法與氣相色譜法一樣，都屬于色譜法，具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)。下面就兩種色譜法的應(yīng)用范圍、儀器構(gòu)造等不同點(diǎn)進(jìn)行比較。
一、氣相與液相的概念
氣相
氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)(溶解度)的微小差異，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配使原來只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果而使不同組分得到分離。
液相
高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而,使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬)；同時，柱后連有高靈敏度的檢測器可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。
二、應(yīng)用范圍
氣相
有著分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等特點(diǎn)。受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析，一般對500℃以下不易揮發(fā)或受熱易分解的物質(zhì)部分可采用衍生化法或裂解法。
液相
高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此，不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%)。原則上，都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
三、氣相儀器構(gòu)造
由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態(tài)。
1.柱箱：
色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個組份在色譜柱中經(jīng)過反復(fù)多次分配后得到分離，從而達(dá)到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進(jìn)樣器和檢測器，因此，進(jìn)樣器和檢測器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細(xì)管柱并且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作，因此，采用微機(jī)對柱箱進(jìn)行溫度控制，并且由于設(shè)計合理，柱箱內(nèi)的梯度很小。
對于一些成份復(fù)雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進(jìn)行三階程序升溫控制。且程序設(shè)定后自動運(yùn)行無需人工干預(yù)，降溫時還能自動后開門排熱。
2.進(jìn)樣器：
進(jìn)樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進(jìn)樣器還必須將其汽化。因此，采用微機(jī)對進(jìn)樣器進(jìn)行溫度控制。
根據(jù)不同種類的色譜柱及不同的進(jìn)樣方式，共有五種進(jìn)樣器可供選擇：
填充柱進(jìn)樣器
毛細(xì)管不分流進(jìn)樣器附件
毛細(xì)管分流進(jìn)樣器附件
毛細(xì)管分流/不分流進(jìn)樣器
六通閥氣體進(jìn)樣器
3.檢測器：
檢測器的作用是將樣品的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為物理信號(電信號)。
檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，采用微機(jī)對檢測器進(jìn)行溫度控制。
根據(jù)各種樣品的化學(xué)物理特性，共有五種檢測器可供選擇：
氫火焰離子化檢測器(FID)；
熱導(dǎo)檢測器(TCD)；
電子捕獲檢測器(ECD)；
氮磷檢測器(NPD)；
火焰光度檢測器(FPD)；
4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
四、高效液相儀器構(gòu)造
高效液相色譜儀主要有：進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。
1.進(jìn)樣系統(tǒng)
一般采用：隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4×107Pa流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值。
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。
色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)，固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。
因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小、微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。
這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4.檢測系統(tǒng)
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種：
(1)紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。
其特點(diǎn)：使用面廣(如，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測下限為10-10g/mL)；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測；糖類化合物的檢測使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡單，但是，靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL)，流動相的變化會引起折光率的變化；因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如，多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等。。。)的測定，其靈敏度很高(檢測下限為10-12～10-14g/mL)痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。
5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
五、高效液相色譜與氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)和不足分析
只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用高效液相色譜分析。
氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運(yùn)載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運(yùn)載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性；另外，可作流動相的化合物多，選擇余地廣。
與氣相色譜相比，高效液相色譜儀的另一個優(yōu)點(diǎn)是：樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集?；厥帐嵌康?，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。
高效液相色譜不足的是，日前，檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對柱效率及色譜分離的影響。
以上內(nèi)容由捷配儀器儀表網(wǎng)小編為您整理提供，希望能幫到您，祝您工作學(xué)習(xí)愉快
1、高效液相色譜儀的基本工作原理
高效液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。
高壓泵從溶液貯器中抽走流動相，流經(jīng)整個儀器系統(tǒng)，形成密閉的液體流路。樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測器，使已被分離的組分逐一被檢測器收集，并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蠼?jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對記錄的峰值進(jìn)行存儲和計算[1]。
液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過程是指物質(zhì)分子在相對運(yùn)動的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動相。當(dāng)液體樣品在載體流動相的推動下，在液-固兩相間作相對運(yùn)動時，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)(K)不同，則使各自的移動速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過多次分配，從而達(dá)到使混合物分離的目的。
2、輸液泵的常見故障及對策：
輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個單向閥組成，用馬達(dá)帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。
2.1單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。
為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的溶液沖洗整個系統(tǒng)。
氣泡進(jìn)入閥中會緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會明顯改變。此時，應(yīng)立即打開泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾櫇癖脙?nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊。
采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。
2.2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，因?yàn)檫@會損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動而流動相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損，應(yīng)及時沖洗。當(dāng)墊圈損壞時，表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。
為避免上述故障的發(fā)生，我們在分析工作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
?、?使用超純水(18MΩ.cm)、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相；
?、?配好的流動相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也可以在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。
?、?泵在起動前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。
?、?用緩沖鹽洗脫時，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。
3、色譜分離柱的使用與維護(hù)
在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。
3.1怎樣維護(hù)好色譜分離柱
加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個樣品后需更換新柱芯。
避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵啟動太快、柱切換等操作。用手動進(jìn)樣閥時的壓力變化不大，自動進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會造成壓力沖擊。
合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn)，一是根據(jù)待測組分的分子量的大??；二是根據(jù)流動相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動相PH值在3-7之間，極端PH值(>8)的流動相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢，其性能突破了傳統(tǒng)高效液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對象、流動相的條件選擇合適的分離柱，茫然時可向公司的技術(shù)人員咨詢。
定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。
高效液相色譜儀分析中進(jìn)樣基線很好，保留時間能鎖定，壓力也穩(wěn)定，但是峰面積差別很大，大概有2倍的差別，這種情況出現(xiàn)的原因可能是多方面的，建議采用以下方法解決：
1、調(diào)換一根新色譜柱，如果情況一樣，則排除柱子的原因。
2、將在線過濾器拆下，用超聲波清洗，如果結(jié)果一樣，說明與在線過濾器無關(guān)。
3、考慮是不是進(jìn)樣閥有問題或者定量環(huán)堵。建議多進(jìn)幾針樣品，看是否有規(guī)律，如果沒有規(guī)律，應(yīng)檢查一下進(jìn)樣器的其他部位，如果是進(jìn)樣器系統(tǒng)出現(xiàn)問題，應(yīng)盡快解決之。
4、對進(jìn)樣器清洗一下，清洗干凈后先進(jìn)一針空白，再進(jìn)樣，看看結(jié)果如何，如果有明顯減少，那可能是進(jìn)樣器污染，有樣品殘留在進(jìn)樣閥體內(nèi)，在切換的過程中被流動相帶入色譜柱。
5、考慮樣品溶液是否均勻。建議同一個濃度連續(xù)進(jìn)樣5次，看一下結(jié)果如何變化，有沒有規(guī)律；如果是樣品溶液不均勻，可以再攪拌一下。
6、考慮光源是不是正常。
7、考慮濃度是否在線性范圍內(nèi)。有時候定量時濃度太高或太低都會產(chǎn)生較大的分析誤差。
8、考慮取樣方式是否正確，每次取樣后是否對針頭外面的附著液進(jìn)行清除。
9、高效液相色譜儀的計算機(jī)軟件編制可能存在問題。對比可以適當(dāng)改變軟件。
449717568
