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液相色譜柱的保護(hù)與再生 液相色譜解決方案

時(shí)間:2020-05-17    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
  樣品中強(qiáng)保留物質(zhì)逐漸在色譜柱中積累造成液相色譜儀色譜柱的污染,情況嚴(yán)重的直接造成色譜柱報(bào)廢。為延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,常用到的方法是色譜柱保護(hù)與再生。
 
  液相色譜儀色譜柱在色譜分析系統(tǒng)中主要起著分離檢測(cè)物質(zhì)的作用,如同色譜系統(tǒng)的心臟,同時(shí)也是易損耗品。
 
  色譜柱在吸附樣品時(shí),樣品中所含有的鹽、脂質(zhì)、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)都有可能與色譜柱發(fā)生相互作用,一些保留值較小的物質(zhì)如鹽類比較容易被沖出色譜柱,而一些保留性較強(qiáng)的組分,流動(dòng)相溶液不足以把這些物質(zhì)洗脫下來,多次上樣后,這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。
 
  當(dāng)這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使之形成新的固定相而改變分離機(jī)理,以致樣品保留時(shí)間會(huì)波動(dòng),會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
 
  色譜柱保護(hù)
 
  為了延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,前面已經(jīng)指出,應(yīng)在分析柱前連接一個(gè)小體積的保護(hù)柱。保護(hù)柱是內(nèi)徑為1.0mm、2.1mm、3.2mm、4.6mm或10mm、20mm、40mm,長(zhǎng)7.5mm、10mm或20~60mm的短填充柱,通常填充和分析柱相同的填料(固定相),可看作是分析柱的縮短形式,安裝在分析柱前。
 
  其作用是收集、阻斷來自進(jìn)樣器的機(jī)械和化學(xué)雜質(zhì),以保護(hù)和延長(zhǎng)分析柱的使用壽命。一只1cm長(zhǎng)的保護(hù)柱就能提供充分的保護(hù)作用。若選用較長(zhǎng)的保護(hù)柱,可降低污染物進(jìn)入分析柱的機(jī)會(huì),但會(huì)引起譜帶擴(kuò)張。因此選擇保護(hù)柱的原則是在滿足分離要求的前提下,盡可能選擇對(duì)分離樣品保留低的短保護(hù)柱。
 
  保護(hù)柱也可裝填和分析柱不同的填料,如較粗顆粒的硅膠(10~15um)或聚合物填料,但柱體積不宜過大,以降低柱外效應(yīng)的影響。
 
  保護(hù)柱裝填的填料較少,價(jià)格較低,其為消耗品,通??煞治?0~100次樣品,柱壓力降呈現(xiàn)增大的趨向就是需要更換保護(hù)柱的信號(hào)。
 
  現(xiàn)在市場(chǎng)供應(yīng)的結(jié)構(gòu)新穎可更換柱芯式設(shè)計(jì)的保護(hù)柱,由保護(hù)柱套和可更換式保護(hù)柱芯兩部分組成。
 
  對(duì)硅膠基體的鍵合固定相,流動(dòng)相的pH值應(yīng)保持在2.5~7.0之間。具有極端值的流動(dòng)相會(huì)溶解硅膠,而使鍵合相流失。
 
  使用水溶性流動(dòng)相時(shí),為防止微生物繁殖引起柱阻塞,應(yīng)加入0.01%的疊氮化鈉,以抑制微生物的繁殖。對(duì)不潔凈的樣品,要使用0.45um濾膜過濾或經(jīng)固相萃取器凈化后再進(jìn)樣。
 
  進(jìn)行正式分析前,應(yīng)先用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱,以保持色譜柱處于平衡狀態(tài)。當(dāng)使用乙醇、異丙醇、乙酸等黏度大的流動(dòng)相時(shí),色譜柱的平衡時(shí)間要延長(zhǎng),甚至要加倍。
 
  對(duì)反相C18 鍵合相柱,除去柱中含有的緩沖溶液鹽類或水溶性物質(zhì)時(shí),不應(yīng)使用純水沖洗。因?yàn)镃18鍵合相像一條長(zhǎng)鏈將硅膠黏結(jié),當(dāng)有有機(jī)溶劑存在時(shí),其表面被流動(dòng)相潤(rùn)濕,C18長(zhǎng)鏈完全展開,像海水中的海藻一樣。當(dāng)純水或緩沖溶液通過時(shí),C18鍵合相與其不浸潤(rùn),鍵合相表面會(huì)塌陷,從而將溶劑、樣品分子或無機(jī)鹽分子包合。此時(shí)僅用純水無法將包合物洗脫出,應(yīng)使用含5%有機(jī)溶劑的水溶液沖洗,才可清除無機(jī)鹽或水溶性物質(zhì)。
 
  硅膠、氧化鋁或正相鍵合相柱,應(yīng)保存在流動(dòng)相中。氰基柱不能保存在純有機(jī)溶劑(如甲醇或乙腈)中,應(yīng)保留在欲使用的流動(dòng)相中;氨基柱好保存在乙腈中,而非流動(dòng)相,并且應(yīng)注意不可使用丙酮作流動(dòng)相。C18反相柱應(yīng)保存在純甲醇溶劑中,對(duì)填充高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非極性固定相也可用此法保存。
 
  色譜柱再生
 
  對(duì)使用時(shí)間較長(zhǎng)、柱效逐漸下降的色譜柱,可用下述方法進(jìn)行快速再生,以除去微量不潔雜質(zhì)在柱頭的聚積。
 
  正相柱:用下述極性強(qiáng)且能互溶的有機(jī)溶劑來洗滌色譜柱,每種溶劑每次用30mL清洗,按庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5%甲醇水溶液次序沖洗(洗脫劑的極性依次遞增),后再用純甲醇通過柱將水分帶出,拆下柱置于氣相色譜儀柱箱中升溫至75℃,以除去水分。另應(yīng)注意不能使用乙醇,它會(huì)使柱喪失柱效。
 
  反相柱:用極性溶劑每種30mL,按以下順序清洗:5%甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA鈉鹽)、5%甲醇水溶液、甲醇、甲醇-氯仿(1:1)混合液、甲醇、5%甲醇水溶液。后保存在甲醇溶劑中。
 
  當(dāng)色譜柱的性能變得很差時(shí),可采用下述兩種方法,作后的補(bǔ)救。
 
  一種方法是修補(bǔ)柱頭并同時(shí)更換不銹鋼燒結(jié)片。當(dāng)取下燒結(jié)片發(fā)現(xiàn)柱頭塌陷或填料被雜質(zhì)污染時(shí),可挖掉0.5mm左右的固定相,再重新填充同樣的干燥固定相,用少量流動(dòng)相潤(rùn)濕,再填充干燥的固定相與柱口平齊(必要時(shí)用光滑的不銹鋼棒壓緊),如此重復(fù)3~5次。
 
  再換上新的不銹鋼燒結(jié)過濾片,擰緊結(jié)頭,與高壓泵連接,用流動(dòng)相沖洗20min,若柱壓力降恢復(fù)正常,可連接檢測(cè)器,測(cè)柱效。若柱效恢復(fù)就可繼續(xù)使用。若柱壓力降恢復(fù)正常,但柱效仍偏低,表明柱頭未填充緊密,仍有空隙,此時(shí)應(yīng)重復(fù)上述操作,直至柱壓力降恢復(fù)正常、柱效也恢復(fù)正常才可繼續(xù)使用。
 
  另一種方法是倒沖色譜柱。此法適用于已修補(bǔ)過柱頭,柱壽命已達(dá)中后期的色譜柱。柱逆向使用后柱效會(huì)損失較大(約30%),倒沖柱可檢查柱頭不銹鋼燒結(jié)片是否堵塞。若已堵塞在倒沖柱時(shí),可觀察到柱壓力降減小,待柱壓力降恢復(fù)正常,再將色譜柱按原方向安裝使用。
 
  柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
 
  色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護(hù)色譜柱。
 
  1、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。
 
  2、應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然,流?dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。
 
  3、一般說來色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
 
  4、選擇使用適宜的流動(dòng)相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)。
 
  5、避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處 理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
 
  6、經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50~75ml。
 
  7、避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相;如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈。
 
  8、進(jìn)樣樣品要提純;
 
  9、嚴(yán)格控制進(jìn)樣量,不要超載。
 
  10、每天分析測(cè)定結(jié)束后,都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?,好用洗脫能力?qiáng)的洗脫液沖洗,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí),使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道,不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘。
 
  11、大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5,盡量不超過該色譜柱的pH范圍。
 
  12、按說明書保存色譜柱,禁止講緩沖液留在柱內(nèi)過夜,注意反相柱不能用純水長(zhǎng)時(shí)間沖。
 
  13、不建議拆開柱子,自己更換填料

高效液相色譜各結(jié)構(gòu)部件的維護(hù)

  1、流動(dòng)相的要求:

  高效液相級(jí)色譜醇,二次蒸餾水,緩沖鹽一定要過濾;流動(dòng)相脫氣至關(guān)重要(可采用抽濾,超聲波脫氣等方法)

  2、吸濾頭:

  特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞;亦可用注射器吸取流動(dòng)相通過吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗;清洗不成功則需要更換。

  3、單向閥

  如遇到泵壓不穩(wěn)或流動(dòng)相不能抽取,則可能是單向閥出現(xiàn)問題,卸下用異丙醇超聲波清洗,清洗時(shí)須按其安裝的方向放置在小燒杯中,切記不可與安裝方向倒置超洗!

  4、泵頭:

  泵頭漏液或出現(xiàn)其它故障一般要申請(qǐng)維修(如漏液,或更換柱塞桿及其密封墊等)

  5、過濾器:

  當(dāng)色譜峰出現(xiàn)異常情況時(shí),有可能是此部件被污染,拆下用異丙醇超洗或更換過濾墊片。

  6、排液閥:

  此處不能完全密封或漏液時(shí)一般是其中的墊片污染或磨損,可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。

  7、手動(dòng)進(jìn)樣器:

  平時(shí)應(yīng)注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態(tài)及進(jìn)樣分析狀態(tài)清洗;如出現(xiàn)漏液現(xiàn)象,原因極可能為轉(zhuǎn)子密封墊磨損或污染,一般須申請(qǐng)維修或更換配件。

  8、流通池:

  在色譜峰不正常時(shí)會(huì)可能是此部件補(bǔ)污染??刹鹦逗笕〕銎渲械膲|片用異丙醇超洗(可根據(jù)說明書進(jìn)行操作或申請(qǐng)維修)。

  9、工作站

  出現(xiàn)死機(jī)可重起計(jì)算機(jī);不正常運(yùn)行時(shí),首先可更換電腦測(cè)試其硬件故障;或在本機(jī)上重新插拔接口、重新安裝軟件。

標(biāo)簽: 高效液相色譜
高效液相色譜 高效液相色譜各結(jié)構(gòu)部件的維護(hù)_高效液相色譜

總結(jié)幾個(gè)液相色譜柱的問題

  色譜柱是液相色譜儀的核心,在我們使用液相色譜儀的時(shí)候,保證液相色譜柱的柱效,延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命是很重要的事情,當(dāng)我們使用的時(shí)候色譜柱如果出息壓力過高或者過低等問題都是屬于柱壓?jiǎn)栴}。液相色譜柱如果壓力過高是因?yàn)橹永锩娈a(chǎn)生了雜質(zhì),造成液體的流動(dòng)力加大而所造成。下面為大家總結(jié)的幾個(gè)液相色譜柱的問題?! ?、流動(dòng)相的前處理:  流動(dòng)相或楊平中雜質(zhì)堵塞色譜柱進(jìn)口濾片,導(dǎo)致壓力升高。這是由于流動(dòng)相可能沒有過濾,或過濾不徹底,使固體雜質(zhì)滯留于濾板上所致。另一個(gè)方面也可能沒有使用預(yù)保護(hù)柱所致?! ?、樣品的沉淀:  當(dāng)流動(dòng)相與溶解樣品的溶劑不一致時(shí),樣品進(jìn)入色譜柱時(shí),可能因溶解度降低而沉淀出來吸附于柱內(nèi),造成壓力升高?! ?、晶體的析出:  使用含有緩沖液的流動(dòng)相時(shí),緩沖液中的無機(jī)鹽可能會(huì)殘留在體系之中,它們會(huì)因在新流動(dòng)相中的溶解度降低而析出阻塞而壓力升高。  4、細(xì)菌或霉菌孳生:  流動(dòng)相中、管路中或柱子進(jìn)口處繁殖、生長(zhǎng)霉菌堵塞濾板,導(dǎo)致壓力升高。所以在使用磷酸鹽緩沖液時(shí)一般要現(xiàn)配現(xiàn)用?! ?、溶質(zhì)吸附:  一些溶質(zhì)在色譜柱上有較強(qiáng)大的吸附力,洗脫時(shí)流動(dòng)相也難以清除掉,累積的未洗脫溶質(zhì)也會(huì)造成阻力增大從而造成壓力升高。  6、流動(dòng)相更換過度較快:  當(dāng)改變流動(dòng)相體系時(shí),不徹底的更換使不同性質(zhì)、互不混溶的流動(dòng)相存在于同一個(gè)體系之中,也會(huì)造成壓力升高?! ?、壓力脈沖:  運(yùn)行過程中,有時(shí)會(huì)產(chǎn)生整個(gè)液相色譜儀系統(tǒng)內(nèi)壓力的突然升降。如泵壓力變化,此所形成的壓力脈沖會(huì)造成多孔填料的崩壞和柱床結(jié)構(gòu)的微小變化,填料微屑的長(zhǎng)期積累也可能會(huì)使柱床阻力增大,造成壓力升高?! ∫陨蠋追N出現(xiàn)壓升高的原因,下文提出的解決方法:  處理對(duì)于緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)的情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應(yīng)提高流速?zèng)_洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;如果柱壓還是降不下來,則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上,用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí),如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。  對(duì)于樣品污染沉積的情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上?! ∫合嗌V柱壓過低的現(xiàn)象一般是由于色譜系統(tǒng)泄漏造成的,其處理方法:尋找各個(gè)接口處,特別是色譜柱兩端的接口,把泄漏的地方旋緊即可?! ×硗膺€有一中可能是柱壓不穩(wěn),忽高忽低,更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸上液體,原因就是泵里進(jìn)了空氣。  處理方法:打開Purge閥,用3-5ml/min的流速?zèng)_洗,如果不行,則要用專用針筒在排空閥處借助外力吸出氣泡。

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