關(guān)鍵詞: 高效液相色譜法L;膽固醇;大鼠海馬;紫外檢測器
摘要:膽固醇不僅在動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能活動(dòng)中起著關(guān)鍵性作用［1］. 本資料用相對(duì)簡單的高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法測定了不同發(fā)育時(shí)期的大鼠海馬膽固醇含量.
1材料和方法
1.1材料
湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康雄性Wistar乳鼠（出生24 h內(nèi)）、幼鼠（28~30 d，體質(zhì)量40~60 g）和成鼠（90~100 d， 體質(zhì)量200~250 g）各10只. 乙腈、異丙醇、無水乙醇等都為色譜純?cè)噭?標(biāo)準(zhǔn)膽固醇(HPLC級(jí))為美國Sigma公司產(chǎn)品. VARIAN Prostar 210高效液相色譜儀 (美國VARIAN公司生產(chǎn)),配置Prostar 210高壓泵、VARIAN Prostar 500柱溫箱、手動(dòng)進(jìn)樣器.
1.2方法
1.2.1組織樣品制備將大鼠快速活殺斷頭取海馬稱質(zhì)量,按10 mL/g加無水乙醇在冰臺(tái)上磨成勻漿,在20 600 g, 4℃離心2次，每次20 min,將上清液以0.45 μm的微孔濾膜濾過, 取濾液分裝, -70℃保存待測.
1.2.2配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和測定膽固醇標(biāo)準(zhǔn)膽固醇儲(chǔ)備液(1 g/L):準(zhǔn)確稱取膽固醇66.18 mg溶于25 mL的無水乙醇中. 標(biāo)準(zhǔn)膽固醇工作液:取標(biāo)準(zhǔn)膽固醇儲(chǔ)備液,分別以無水乙醇稀釋使其濃度分別為0.1323, 0.26472, 0.6618, 1.3236, 2.6472 g/L. 美國安捷倫公司反相色譜柱(ZORBAX XDB C18 4.6*250 mm 5 μm, Agilent), 柱溫38℃, 乙腈異丙醇(4∶1, V/V)為洗脫流動(dòng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和樣品中膽固醇進(jìn)行分離洗脫. 流速:0.8 mL/min;檢測波長:208 nm;進(jìn)樣量:20 μL,Varian Prostar 325紫外檢測器和美國Varian公司的LC Workstation V6.2色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢測和處理色譜數(shù)據(jù),獲得膽固醇色譜圖. 計(jì)算結(jié)果：X=10×0.9965×A×B÷CX: 樣品中膽固醇的含量(mg/g). A: 樣品中膽固醇的峰面積. 10: 樣品稀釋倍數(shù)(mL/g). B: 標(biāo)準(zhǔn)膽固醇的含量(g/L). C: 標(biāo)準(zhǔn)膽固醇的峰面積. 0.9965: 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品純度.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)用x±s表示, 變量間比較用F檢驗(yàn).
2結(jié)果
2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在選擇的色譜條件下,膽固醇的保留時(shí)間為13~15 min. 以膽固醇濃度分別為0.1323, 0.26472, 0.6618, 1.3236和2.6472 g/L的標(biāo)準(zhǔn)膽固醇工作液重復(fù)上樣(重復(fù)3次),上樣量為20 μL,以峰面積為縱坐標(biāo)Y, 膽固醇濃度為橫坐標(biāo)X(g/L)，進(jìn)行線性回歸, 得到線性回歸方程為:Y=837148.3+84898179X, 相關(guān)系數(shù)r=0.99993，P<0.01. 最低檢測限為10 mg/L.
2.2回收率準(zhǔn)確稱取已知含量(12.8 mg/g)的樣品0.1 g(精確至0.0002 g) ,準(zhǔn)確加入1 mL濃度為1.3236 g/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 按上述方法制備組織樣品后加無水乙醇做平行樣5個(gè)，測定膽固醇含量. 平均回收率為99.94%.
2.3精密度取濃度為1.3236 g/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,測定結(jié)果表明其變異系數(shù)為1.2%.
2.4樣品中膽固醇含量乳鼠、幼鼠和成鼠海馬樣品膽固醇色譜圖. 膽固醇都在相同的保留時(shí)間被洗脫出來，其含量分別為2.92±0.03,11.20±1.41,12.91±1.25(mg/g), 經(jīng)F檢驗(yàn)和兩兩比較，相互間差別有極顯著性意義（P<0.01）.
3討論
我們用紫外檢測器得到膽固醇最低檢測限達(dá)10 mg/L，回收率和精密度均高. 故此法靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，對(duì)臨床和科研很有價(jià)值.
Mauch等［1］確定glia因子為膽固醇與載脂蛋白E復(fù)合形成的脂蛋白. 膽固醇對(duì)大鼠海馬的發(fā)育和成熟的作用報(bào)道甚少［2,3］. 我們推測，在大鼠發(fā)育過程中，海馬膽固醇含量漸增, 膽固醇對(duì)大鼠海馬發(fā)育和成熟可能發(fā)揮了重要作用［4］.
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高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)， 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)， 在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)， 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程， 各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別， 被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出， 通過檢測器時(shí)， 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。高效液相色譜儀在使用過程中通常會(huì)遇到下面幾個(gè)問題： 1. 色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎？ 不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排 入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色 譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定 就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶 劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。 2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？ 如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。 使 用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì) 變脆。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過 3000psi）。 使用PEEK接頭時(shí)則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。 3. 如何預(yù)防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施: 1).用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑； 2).過濾流動(dòng)相和溶劑； 3).脫氣； 4).每天開始使用時(shí)放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液； 5).不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中； 6).定期更換墊圈； 7).需要時(shí)加潤滑油； 8).查閱有關(guān)泵操作手冊(cè)中的其它建議。 處于良好操作狀態(tài)的泵，應(yīng)該能使色譜圖上的基線平穩(wěn)；保留時(shí)間的重復(fù)性好。在等度洗脫時(shí)壓力波動(dòng)小于2%。梯度洗脫時(shí)壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。 為了使故障發(fā)生后盡快排除，平時(shí)應(yīng)常備密封、單向閥（入口與出口）、泵頭裝置、各式接頭、保險(xiǎn)絲等部件，以及更換工具。使用高效液相色譜儀會(huì)遇到的問題
一.HPLC紫外燈的維護(hù)
對(duì)紫外燈的根本維護(hù)就是在不進(jìn)行測定時(shí)應(yīng)及時(shí)關(guān)燈。具體的做法為：
1.縮短檢測前的開燈時(shí)間
盡量在檢測前1小時(shí)開紫外燈，具體時(shí)間根據(jù)系統(tǒng)的穩(wěn)定時(shí)間而定。太早會(huì)縮短燈的使用壽命太晚會(huì)浪費(fèi)流動(dòng)相，對(duì)色譜柱也不好。
2.檢測結(jié)束后的關(guān)燈
在檢測結(jié)束后應(yīng)立即關(guān)燈，盡量采用儀器自動(dòng)關(guān)燈。有人提出如果當(dāng)天還有檢測工作怎么辦?我認(rèn)為頻繁的開關(guān)對(duì)燈顯然也不利，立即關(guān)燈當(dāng)然是指一天的檢測都結(jié)束后。在一天工作開始時(shí)應(yīng)考慮工作量讓液相在合適的時(shí)候開始工作，保證檢測的連續(xù)性，縮短開燈時(shí)間。如果必須在中間停一段時(shí)間，則應(yīng)視所停時(shí)間而定。
二.HPLC紫外燈的更換
紫外燈何時(shí)更換說法不一。原先一般建議的使用時(shí)間為2000小時(shí)，現(xiàn)在不少液相廠家建議盡量使用1000小時(shí)后更換。我認(rèn)為每個(gè)燈質(zhì)量都不一樣，具體時(shí)間可視燈的能量而定，如我們目前定的標(biāo)準(zhǔn)為800，每周一次檢測燈能量并記錄，當(dāng)能量不足800時(shí)立即更換。
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