30％磷酸水溶液通過酸反應(yīng)和強表面活性劑／洗滌劑的共同作用，可以有效地清潔不銹鋼及其它潤濕的部件。這一方法比更常用的硝酸“鈍化”絕對更有效、且較少損害特別是對日常使用低紫外波長的應(yīng)用來說。這一磷酸清洗步驟不是起鈍化作用，但它是系統(tǒng)鈍化前清洗的第一步。
? 一般來說，對于陽離子的離子色譜分析或配有氧化方式的電化學(xué)檢測器以外的應(yīng)用不需要鈍化系統(tǒng)。因為有真空脫氣機每個通道體積為8m1，可不必用磷酸；中洗全部通道。如果你計劃四個通道都要用，則可用濕灌注的方式以4mL／min流速對每個通道清洗8～1 O分鐘來清洗脫氣機。這一步完成后你必須徹底淋洗管路，用水淋洗2～3次以便將磷酸從溶劑過濾頭等部件沖洗凈。
? 安裝好的HPLC系統(tǒng)的酸清洗和鈍化
? HPLC系統(tǒng)內(nèi)部可能的污染物來自人的觸摸，暴露在實驗室化學(xué)環(huán)境，與零部件制造相關(guān)的殘留物，或來自先前的流動相和樣品的殘余物。
? 雖然系統(tǒng)自身也會逐步地被流動相清洗，但某些釋放出的雜質(zhì)會吸附在色譜柱上以及檢測器潤濕的表面上，因而會降低總的性能。
? 磷酸清洗：
? 通常用于從系統(tǒng)中除去有機雜質(zhì)?？赡苁怯捎谙礈熳饔?，它似乎比強有機溶劑更好也更快。這一步清洗必須在硝酸鈍化之前完成。
? 硝酸鈍化：
? 實際上是作用于不銹鋼表面，在表面上生成均勻的氧化層。這層氧化膜保護不銹鋼免受腐蝕鹵化物，螯合劑，等等并且盡量減少浸出的金屬離子進入流動相。
? 以下應(yīng)用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸鈍化，包括：
? ①所有的氨基酸分析系統(tǒng)； ? ②所有包含電化學(xué)檢測器的系統(tǒng)； ? ③所有要分析無機陽離子，包括過渡金屬的系統(tǒng)； ? ④所有利用柱后添加衍生試劑或絡(luò)合樣品組分的系統(tǒng)。 ? ? 以下應(yīng)用需要在使用前只做磷酸清洗，包括：
? ①所有常規(guī)用途的、可能在低pH環(huán)境下在低紫外檢測波長下運行的HPLC系統(tǒng)； ? ②所有需要高靈敏度性能的梯度紫外檢測系統(tǒng)。
? 系統(tǒng)清洗指南：
? 注意：在實行這個程序時采用適當?shù)陌踩雷o措施準備工作： ? 首先，摘下色譜柱，用兩通或接頭取代色譜柱。在實行這一清洗步驟時，如果有可能選擇監(jiān)測的紫外波長為：254nm。通過軟件或移去電纜的方式取消紫外檢測器的自動回零功能。
? 具體步驟：
? 1、用甲醇徹底沖洗系統(tǒng)，以等比例方式通過泵的所有管路。 ? 2、用水徹底沖洗系統(tǒng)，以等比例方式通過泵的所有管路。 ? 3、以等比例方式通過泵的所有管路導(dǎo)入～30％v／v磷酸水溶液。以1mL/min流速洗大約一個小時。在沖洗期間活動所有的閥，包括：參比閥、進樣閥及旁路閥等等。 ? 4．用水徹底沖洗所有管路和系統(tǒng)。 ? 必要時用6N硝酸HN03重復(fù)以上步驟。否則，跳到第7步。注意：硝酸是一個強紫外吸收溶液。除非絕對需要，不要做鈍化程序。 ? 5．以等比例方式通過泵的所有管路導(dǎo)人6N硝酸水溶液大約是40％。以1mL/min流速洗大約一個小時。 ? 6．用水徹底沖洗系統(tǒng)，仔細檢查是否有任何滲漏，在沖洗期間反復(fù)活動所有的閥，包括：參比閥、進樣閥及旁路閥等等。
? 注意：如果你要用低于270nm的紫外波長作檢測，則需要更大量水的清洗過程，不斷的換新鮮水并活動各個閥沖洗進樣器，等以便從系統(tǒng)中除去所有的痕量硝酸根離子。硝酸清洗后經(jīng)常在幾天之內(nèi)都會觀察到在低紫外波長下有負的基線漂移。勤換水和有耐心是盡快消除紫外本底的關(guān)鍵。 ? 7．返回到甲醇洗，然后繼續(xù)用實驗所需的溶劑沖洗。 ? 8．通過軟件或接上電纜的方式重新使紫外檢測器的自動回零功能恢復(fù).
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液相色譜儀利用混合物在液-固或不互溶的兩種液體之間分配比的差異，對混合物進行先分離，而后分析鑒定的儀器。一般問題主要有以下幾種； 氣泡溢出 流動相內(nèi)有氣泡，關(guān)閉泵，打開泄壓閥，打開purg鍵，清洗脫氣，氣泡不斷從過濾器冒出，進入流動相，無論打開purge鍵幾次，都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，打開泄壓閥，打開purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團已被硝酸破壞，流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥，打開泵，流速調(diào)至1.0～3.0ml/min，純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時即可。 柱壓高 ⑴緩沖液鹽分如（乙酸銨等）沉積于柱內(nèi)； ⑵樣品污染沉積。 處理對于第一種情況先用40～50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速沖洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘；對于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。 無指示 ⑴泵密封墊圈磨損； ⑵大量氣泡進入泵體。 處理對于第一種情況，更換密封墊圈；對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。 不穩(wěn)定 原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。 峰分叉 ⑴色譜柱被污染； ⑵柱頭填料塌陷。 處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。 重復(fù)性差 ⑴進樣閥漏液； ⑵加樣針不到位； ⑶液量不足。 處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進樣量的準確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無機鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命，同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
高效液相色譜以它定量分析結(jié)果準確、分析周期短、分析范圍廣及分析檢測限低等優(yōu)勢，在食品添加劑、藥物成分分析等多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。 本文就液相色譜儀在實際操作時應(yīng)注意的事項及維護做了簡單介紹。 主要部件介紹 輸液系統(tǒng) 輸液系統(tǒng)主要包括在線脫氣裝置、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置。在線脫氣裝置主要功能是流動相在進入柱子前排除氣泡。高效液相色譜柱的填料顆粒小，通過2~5mm的色譜柱受到的流動阻力很大，因此需要通過高壓輸液泵抽取流動相輸送至色譜柱。 高壓泵按輸液性能可分為恒壓、恒流泵。按機械結(jié)構(gòu)可分為：液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵。 進樣器 進樣器是將分析樣品送入色譜柱的裝置，分為手動、自動進樣器兩種。手動進樣器一般配有20~100μL的定量環(huán)。 色譜柱 色譜柱以液體為流動相，以廣義的固相為固定相來進行分析樣品的分離工作。 色譜柱按照分離模式大致可以分為正相色譜柱和反相色譜柱。 檢測器 檢測器是將色譜柱分離出樣品的物理或化學(xué)特性轉(zhuǎn)換為可以測量的電信號，通過色譜圖記錄下來，由色譜圖中的峰形狀判斷分離效果，依據(jù)標物、分析樣色譜圖的出峰時間、峰面積分別對樣品進行定性定量分析。 維護及使用注意事項 1.開關(guān)機操作注意 分析準備工作做好后，依次打開穩(wěn)壓電源、高壓輸液泵、柱溫箱、檢測器，待各部件自檢結(jié)束，打開連接儀器的電腦，啟動工作軟件。分析工作結(jié)束后，關(guān)閉工作軟件，再依次關(guān)閉檢測器、柱溫箱和高壓輸液泵。 2.對流動相的要求 為保證液相色譜儀器的正常使用，所有流動相必須是色譜級的，且經(jīng)過過濾雜質(zhì)、排除氣泡后裝入干凈的流動相貯存瓶中待用。 (1)流動相的物理化學(xué)性能要求 對分析物要有足夠的溶解能力，以利于提高檢驗的靈敏度;流動相的黏度要小，以保證合適的柱降壓;流動相的沸點要低，以利于制備分離時樣品的回收;流動相的PH值一般應(yīng)在2~7.5;使用期限不得超過2天，否則產(chǎn)生細菌污染管路。 (2)流動相的過濾 流動相在使用前都必須經(jīng)過濾，以除去雜質(zhì)微粒。同時要定期清洗吸濾頭，以防雜質(zhì)通過其進入流動相。應(yīng)依據(jù)其是否是水溶性選擇水膜或有機膜(0.45μm或0.22μm)，使用溶劑過濾裝置，通過真空泵抽氣過濾。 (3)流動相的脫氣 流動相必須預(yù)先脫氣，否則易產(chǎn)生氣泡，影響泵的工作。此外，溶解在流動相中的氧能與某些有機溶劑形成有紫外吸收的絡(luò)合物，提高背景吸收，會在梯度洗脫時造成基線漂移或形成鬼峰。 常有的脫氣方法有在線真空脫氣法、超聲波脫氣法、抽真空脫氣法三種。 3.色譜柱的維護及使用注意事項 所有分析樣品zui好把pH值調(diào)節(jié)到適合色譜柱的pH值范圍內(nèi)。進樣要避免超負荷，這是保持色譜柱性能持久良好的重要方法之一。 手動進樣器進樣的話，進樣時動作要快速準確。分析物成分復(fù)雜時，要在色譜柱前加色譜保護柱以保護色譜柱。 每次分析工作開始時，要對色譜柱進行平衡，用含10%流動相中的有機溶劑的水溶液進行排氣和沖洗色譜柱和管路，沖洗30分鐘左右，將色譜柱中的純有機溶劑替換掉，然后再用至少10倍柱體積的流動相平衡色譜柱，直至基線平衡后方可進樣。 每次分析工作結(jié)束后，一定要立即用一定量的水溶液徹底沖洗色譜柱中的緩沖鹽液，再用對被測物洗脫能力強的溶劑來沖洗色譜柱，沖洗時間不能小于1小時，洗脫溶劑的用量至少為柱體積的20倍。 若不及時沖洗色譜柱，雜質(zhì)長時間積累在其中，易堵塞色譜柱，降低柱效性能。 長期這樣，會加速減少色譜柱使用壽命。色譜柱4天以上不使用，應(yīng)從儀器上取下，用封頭螺帽把兩頭緊緊密封。色譜柱保存時注意不要強烈震動、碰撞。 4.高壓輸液泵的維護及使用注意事項 每次分析工作結(jié)束后，都應(yīng)及時清洗泵。當有緩沖鹽做流動相時，緩沖鹽與有機溶劑互相交換前一定要用5%的甲醇水溶液清洗泵，防止鹽在有機相中結(jié)晶損壞泵中各組件。 緩沖鹽溶液的濃度不要過高，要控制在5%以下，否則高濃度的緩沖鹽會磨損密封墊和活塞，降低其使用壽命。長時間使用高濃度的緩沖鹽，必須用10%的異丙醇色譜級溶液清洗泵，從而保護柱塞和密封墊。 輸液泵工作前要設(shè)置工作壓力范圍，正常工作壓力一般不要超過30Mpa，否則經(jīng)常高壓會使密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。平時分析工作要養(yǎng)成記錄壓力的好習(xí)慣，這樣如果工作壓力超過平時正常壓力的10%~15%，就應(yīng)及時查找原因。 5.紫外檢測器的維護及使用注意事項 紫外檢測器有一定的使用壽命，所以平時應(yīng)盡量減少氘燈的使用時間，在柱平衡進行一大半之后，在走基線之前，打開檢測器光源;分析結(jié)束后即可關(guān)閉檢測器光源。 要保持檢測器四周環(huán)境清潔，實驗室盡量少開窗戶，定期地面進行吸塵工作，防止檢測器工作時由于靜電吸附灰塵顆粒覆蓋在光學(xué)元件上。 檢測器池內(nèi)存在氣泡就會產(chǎn)生噪音，噪音會干擾定量分析，所以流動相須充分脫氣后再使用。 應(yīng)定期清洗流通池。如觀察到流通池內(nèi)部無氣泡或臟物，應(yīng)清洗流通池。通過注射器用異丙醇等有機溶劑沖洗池內(nèi)，以清洗透鏡。如是含有緩沖鹽的溶劑作流動相，應(yīng)在使用異丙醇沖洗前用水替換池中原先有的溶劑。高效液相色譜的維護如何？
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