色譜柱是化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)、常用的化工儀器之一,正確而有效的使用方法,不僅能夠延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,也能確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
1、保護(hù)柱
保護(hù)柱是很短的色譜柱,填裝和液相色譜柱相同的填料。正確使用保護(hù)柱,可以起到阻攔一些容易損壞液相色譜柱的物質(zhì)的作用。從而達(dá)到延長(zhǎng)柱子壽命的效果。相反,如果使用”保護(hù)柱”不當(dāng),可能會(huì)縮短色譜柱的使用壽命。例如,在保護(hù)柱使用過(guò)程中,如果污染達(dá)到一定程度而沒(méi)有及時(shí)更換,累積的雜物很可能會(huì)沖入色譜柱中,反而會(huì)造成色譜柱損壞。因此,在使用”保護(hù)柱”時(shí),比較重要的是要知道什幺時(shí)候該換保護(hù)柱。該換的時(shí)候就必須要立即更換。
2、選擇高品質(zhì)的色譜柱
一般認(rèn)為同一廠牌、同一型號(hào)的色譜柱之間的品質(zhì)都相同,對(duì)品質(zhì)管理很嚴(yán)格的廠家而言,這說(shuō)法是成立的。但如果廠家品質(zhì)管理不夠嚴(yán)格,即使是同一批號(hào)的新色譜柱之間的品質(zhì)也有差異。所以,選用色譜柱時(shí)必須選擇管理嚴(yán)格的高品質(zhì)色譜柱,我們知道,任何色譜柱使用過(guò)后都會(huì)產(chǎn)生變化。尤其如在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下使用,色譜柱更易產(chǎn)生變化。因此,應(yīng)盡量選用pH適用范圍大的色譜柱。在開(kāi)發(fā)新分析方法時(shí),許多專家建議不要使用舊色譜柱。因色譜柱一經(jīng)使用。柱性會(huì)改變;如此一來(lái),使用舊色譜柱開(kāi)發(fā)出來(lái)的新分析方法,很可能在再使用同廠牌的新色譜柱分析時(shí)。發(fā)生無(wú)法達(dá)到預(yù)定效果的情況??偟恼f(shuō)。開(kāi)發(fā)新分析方法時(shí)要使用品質(zhì)好的新色譜柱;并且一支色譜柱使用在一種分析方法上;則色譜柱壽命可以延長(zhǎng)。
3、定期沖洗色譜柱。
一般柱子使用一段時(shí)間后總會(huì)有一些雜質(zhì)累積在柱內(nèi),而且這些雜質(zhì)不會(huì)隨著流動(dòng)相出來(lái),會(huì)逐漸影響柱子的品質(zhì)。這些雜質(zhì)在后來(lái)的分析譜圖上出現(xiàn)。從而造成出現(xiàn)怪峰、基線不平等現(xiàn)象。簡(jiǎn)單的解決方法是用較強(qiáng)的流動(dòng)相沖洗。而且每次分析某一產(chǎn)品完成后沖洗。如果分析時(shí)使用緩沖劑﹐可以用水來(lái)取代緩沖劑。先使用有機(jī)和水的混合溶液為流動(dòng)相沖洗緩沖劑。接著再用100%有機(jī)溶劑沖洗。如果直接用100%有機(jī)溶劑沖洗的話,緩沖劑很可能會(huì)沉淀出來(lái),而損壞色譜柱的品質(zhì)。使用10-20倍柱體積的量來(lái)沖洗基本就足夠了??梢詫?00%有機(jī)溶劑沖洗的條件加在分析實(shí)驗(yàn)程序完畢后,如此一來(lái)每天在開(kāi)機(jī)前都會(huì)用100%機(jī)溶劑沖洗。一般硅膠柱可以反沖洗處理﹐即是在將沖洗前將色譜柱倒反接后再?zèng)_洗。打算使用反沖洗處理前,先參考色譜柱的保養(yǎng)說(shuō)明書(shū)。所以要真正保護(hù)色譜柱,使柱子的壽命延長(zhǎng),是使用”保護(hù)柱”和定期沖洗色譜柱
色譜柱的使用壽命,除了與所分析的樣品和流動(dòng)相及使用頻率有關(guān)系外,最主要的是與日常的維護(hù)密切相關(guān)。色譜柱的使用壽命主要是柱效和柱壓兩個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量,如果一支色譜柱柱效太低或柱壓太高,通常被認(rèn)為該色譜柱已經(jīng)結(jié)束。因此,延長(zhǎng)色譜柱使用壽命的關(guān)鍵是,消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的維護(hù)方法:
一、流動(dòng)相的PH應(yīng)在使用的范圍內(nèi)
流動(dòng)相超過(guò)其PH范圍將會(huì)導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂,使柱效下降,使用壽命變短。由于流動(dòng)相的PH控制不當(dāng)而對(duì)色譜柱造成的損害,通常很難是色譜柱恢復(fù),因此必須認(rèn)真對(duì)待,嚴(yán)格控制流動(dòng)相的PH值。
二、去除樣品和流動(dòng)相中的固體顆粒
樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板,篩板被堵住不僅會(huì)引起柱壓的升高,而且也會(huì)引起柱效下降,因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均,導(dǎo)致色譜峰型拖尾、變寬,從而使柱效下降。因此,建議使用超純水和色譜純?cè)噭?,在分析樣品前?duì)樣品進(jìn)行針筒過(guò)濾,流動(dòng)相過(guò)0、45μm濾膜。
三、使用保護(hù)柱或在線過(guò)濾器
樣品和流動(dòng)相經(jīng)過(guò)濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì),因?yàn)楸玫哪p、密封圈和管路的老化也會(huì)產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì),這些固體顆粒被流動(dòng)相帶入色譜柱,堵塞篩板,導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。保護(hù)柱和在線過(guò)濾器上都有篩板,其孔徑與色譜柱孔徑相同,因此可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱,有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例,因此,除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾外,建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器。
如果色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的,可選擇以下方式進(jìn)行補(bǔ)救:
1、先在色譜柱前加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器,然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min、
2、先在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器,然后反向使用。
四、正確使用緩沖鹽
緩沖鹽通常易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑,因此緩沖鹽使用不當(dāng)會(huì)使其析出,堵塞填料基質(zhì)上的微孔和顆粒間的空隙,使填料板結(jié),柱壓上升;同時(shí)阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈自由舒展,使色譜柱的保留能力下降,柱效降低。緩沖鹽析出后,去除非常困難,因此,正確的使用緩沖鹽對(duì)延長(zhǎng)色譜柱使用壽命非常重要。
正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出,因此正確使用緩沖鹽的方法可歸結(jié)為一句話:使用前要過(guò)濾,使用后要沖洗。具體方法如下:
1、等度條件:使用緩沖鹽前和使用后需用過(guò)渡流動(dòng)相以1、0ml/min流速?zèng)_洗60min;使用后去除緩沖鹽的另一個(gè)方法是用過(guò)渡流動(dòng)相以0、2ml/min流速?zèng)_洗色譜柱過(guò)夜。
2、梯度條件:用含有緩沖鹽的流動(dòng)相跑梯度之前,用與初始流動(dòng)相組成相同的過(guò)渡流動(dòng)相以1、0ml/min流速?zèng)_洗60min,再用該過(guò)渡流動(dòng)相以1、0ml/min沖洗色譜柱120min。含緩沖鹽流動(dòng)相的梯度設(shè)定應(yīng)盡量平緩,以避免梯度過(guò)程中緩沖鹽析出。
注意:過(guò)渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相的組成與分析流動(dòng)相相同,區(qū)別只是過(guò)渡流動(dòng)相不含緩沖鹽。
3、緩沖鹽析出的補(bǔ)救方法:
方案1:用甲醇/20/80以1、0ml/min流速35攝氏度條件下反向沖洗色譜柱120min
方案2:用甲醇/水=20/80以0、2ml/min流速反向沖洗色譜柱過(guò)夜。
五、防止強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱上存留
強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積,對(duì)樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為,不僅引起峰型變寬、拖尾,使柱效下降,同時(shí)也會(huì)引起保留時(shí)間的變化,累積到一定程度時(shí)還會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。由于強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物對(duì)色譜分離的影響是一個(gè)累積效應(yīng),需要一定的時(shí)間才會(huì)體現(xiàn)出來(lái),但對(duì)許多藥品特別是復(fù)雜樣品而言,很難判斷其是否是含有強(qiáng)保留物質(zhì),因此要防止強(qiáng)保留物質(zhì)的累積,需要在每天的日常維護(hù)中用純甲醇或乙氰清洗色譜柱。
1、反相柱
分別用甲醇:水=90:10、純甲醇、二氯甲烷等溶劑著流動(dòng)相,依次沖洗,每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的色譜柱體積。然后再以相反的次序沖洗。
2、正相柱
分別用正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇等溶劑做流動(dòng)相,順次沖洗,每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的柱體積(異丙醇粘度大,可降低流速,避免壓力過(guò)高)。注意使用溶劑的次序不要顛倒,用甲醇沖洗完后,再以相反的次序沖洗至正己烷。所有的流動(dòng)相必須嚴(yán)格脫水。
3、離子交換柱
長(zhǎng)時(shí)間在緩沖溶液中使用和進(jìn)樣,將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力下降,。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽(yáng)離子柱再生,反之,用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
用戶還可以選擇能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑為流動(dòng)相做正方向和反方向沖洗。但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復(fù)到新柱的水平的。
如果柱子裝反了,可以調(diào)回來(lái),但可能會(huì)造成柱內(nèi)擔(dān)體塌陷。在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。