凱氏定氮儀主要用來檢測糧食、食品、乳制品、飲料、飼料、土壤、水、藥物、沉淀物和化學(xué)品等中的氨氮、蛋白質(zhì)氮等含量。檢測結(jié)果符合GB/T6423-94規(guī)定指標。
（一）消化
1、準備6個凱氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。
2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉(zhuǎn)動燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底部，以保證樣品完全消化。消化時放出的氣體內(nèi)含SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應(yīng)在通風櫥中進行。消化完全后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。
（二）蒸餾和吸收
蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。
1、儀器的洗滌
儀器安裝前，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上。
儀器使用前，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸汽洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重復(fù)蒸汽洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。
首先在蒸汽發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石（或毛細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室，但玻璃杯內(nèi)的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸汽發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能進入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發(fā)燙開始計時，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈。沖洗完畢，夾緊蒸汽發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到反應(yīng)室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。
2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收
由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)，初學(xué)者宜先用無機氮標準樣品進行反復(fù)練習(xí)，再進行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標準硫酸銨測試三次。
取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸。準確吸取2mL硫酸銨標準液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10mL30％NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸汽發(fā)生器，進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸餾3～5min，移動錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準備滴定。
在一次蒸餾完畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸汽發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應(yīng)完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復(fù)沖洗干凈后，即可進行下一個樣品的蒸餾。按以上方法用標準硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。
3、未知樣品及空白的蒸餾吸收
將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。
加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標準硫酸銨的蒸餾進行。
由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，必須加入熱蒸餾水5mL稀釋之，如果有結(jié)晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應(yīng)室。此外，還應(yīng)當注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)晶，造成堵塞。
（三）凱氏定氮儀滴定
樣品和空白蒸餾完畢后，一起進行滴定。
打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內(nèi)溶液呈暗灰色時，用蒸餾水將錐形瓶內(nèi)壁四周淋洗一次。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色，應(yīng)再小心滴入標準鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內(nèi)溶液顏色變化，暗灰色在一二分鐘內(nèi)不變，當視為到達滴定終點。若呈粉紅色，表明已超越滴定終點，可在已滴定耗用的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白對照液接受瓶內(nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數(shù)，供計算用。
凱氏定氮儀是用凱氏方法檢測谷物、食品、飼料、水、土壤、淤泥、沉淀物和化學(xué)品中的氨、蛋白質(zhì)氮含量、酚、揮發(fā)性脂肪酸、氰化物、二氧化硫、乙醇等含量。具有相當好的性價比，僅僅滴定過程需要人工操作一下，非常適合實驗室及檢驗機構(gòu)常規(guī)檢測。廣泛用于食品、農(nóng)作物、種子、土壤、肥料等樣品的含氮量或蛋白質(zhì)含量分析。
工作原理：
凱氏定氮法測定試樣時，需經(jīng)過消解、蒸餾、滴定3個過程，樣品的消解就是將含氮的有機化合物與硫酸和催化劑一同加熱消化，使有機氮分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸按樣品經(jīng)過消解后將試樣中有機氮轉(zhuǎn)化為無機氮，再將消解后的樣品加入到定氮儀蒸餾器中進行堿解蒸餾。
凱氏定氮儀就是完成無機氮的堿解蒸餾過程，即在經(jīng)過消解后的硫酸按中加入堿液，在熱蒸汽下進行堿解蒸餾，具體如下:
凱氏定氮儀可以自動完成對樣品的定量加堿、加酸、自動蒸餾過程，當被測樣品完全消解后，反應(yīng)中釋放的氨氣與水蒸氣經(jīng)過冷凝管冷凝后，被收集在裝有硼酸吸收液(含有甲基紅一澳甲酚綠混合定氮指示劑)的三角瓶中，最后用標準酸液進行滴定。
凱氏定氮儀是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉(zhuǎn)變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。因其蛋白質(zhì)含量測量計算的方法叫做凱氏定氮法，故被稱為凱氏定氮儀又名定氮儀、蛋白質(zhì)測定儀、粗蛋白測定儀。
凱氏定氮儀使用需注意哪些方面？
1、凱氏定氮儀稀釋水采用中性去離子水；
蒸汽發(fā)生瓶內(nèi)的水必須保持酸性；硼酸吸收液配制時應(yīng)用中性去離子水，避免堿性物質(zhì)的混入，盛裝硼酸吸收液的容器應(yīng)刷洗干凈；堿液應(yīng)用中性去離子水配置；滴定用的標準酸必須按照標準配制和標定。上機測試樣品前，應(yīng)打開凱氏定氮儀預(yù)熱，放一支消化管空蒸一次，排除蒸餾管路中的空氣。蒸餾時必須加堿，加入堿的作用一是中和硫酸，二是使溶液處于強堿性，這樣才能使（NH4）2SO4變成NH3被硼酸吸收，通常是消化取用濃硫酸的四倍體積（40%NaOH）。硫酸銅可作為催化劑,并在蒸餾時作堿性反應(yīng)指示劑,氫氧化鈉是否足量.可借助硫酸銅在堿性條件下生成的褐色沉淀或深藍色的銅氨絡(luò)離子指示。若溶液的顏色不改變，則說明所加的堿液不足。蒸餾是否完全，凱氏定氮儀可用精密pH試紙測冷凝管的冷凝液來確定，中性說明已蒸餾完全。凱氏定氮儀目前主要是以蒸餾體積與設(shè)置時間（經(jīng)驗值）確保蒸餾完全。蒸餾結(jié)束后，滴定主要是是分為人工滴定和機器自動滴定計算和打印實驗結(jié)果。要求操作者根據(jù)實際情況，按照要求操作。
2、樣品前處理：
樣品應(yīng)盡量選取具有代表性的，大塊的固體樣品應(yīng)用粉碎設(shè)備打得細小均勻，液體樣要混合均勻。
3、模塊化消解裝置消化樣品：
消化過程中，首先確保濃硫酸量足夠，如樣品脂肪含量較高時，應(yīng)適當增加硫酸量；其次對某些樣品炭化易產(chǎn)生泡沫，這時可采用消解爐曲線升溫或手動控制升溫，讓消解溶液沸騰均勻后再提高消解溫度，直至消化液呈透明藍綠色再消化0.5h或1h。因為炭化過程中，升溫速度過快會使樣品溢出消化管或濺起粘附在管壁導(dǎo)致無法消化完全而造成氮損失，影響凱氏定氮儀結(jié)果準確性。
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