色譜柱規(guī)范化管理和保養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)
高效液相色譜法是20世紀(jì)70年代急劇發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效、快速的分離、分析技術(shù)。液相色譜法是指流動(dòng)相為液相的色譜技術(shù),在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上,引入氣相色譜法理論,在技術(shù)上采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分析效率高和操作自動(dòng)化,它具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點(diǎn)。它是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑,緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品,由流動(dòng)相帶入柱內(nèi),在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器,色譜信號(hào)由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。
高效色譜柱是高效液相色譜的心臟,在高效液相色譜儀的使用中,保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。色譜柱使用時(shí)間后就會(huì)出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間改變等變化,如不采取措施,將會(huì)縮短色譜柱的使用壽命,影響工作效率,并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此,有必要加強(qiáng)和規(guī)范色譜柱的管理,從而延長(zhǎng)
色譜柱的使用壽命。本文從影響色譜柱使用壽命的幾個(gè)因素出發(fā),從管理的角度,探討色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)。
1 色譜柱的類型
常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠、離子交換樹脂、凝膠或玻璃微球等填充劑。在化學(xué)鍵合硅膠中以十六烷基硅烷鍵合硅膠常用,辛基硅烷鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。近年來(lái),由于蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)分離提純技術(shù)的飛速發(fā)展,離子交換色譜柱、凝膠色譜柱的應(yīng)用也越來(lái)越廣。
2 影響色譜柱使用壽命的因素
2.1 流動(dòng)相
在以水溶液為流動(dòng)相時(shí),水溶液中的微生物例如細(xì)菌容易生長(zhǎng),當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí),一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術(shù)的問(wèn)世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜柱也有影響,特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料,水溶液的pH最適范圍在2~7.5之間,當(dāng)pH>8時(shí),硅膠會(huì)釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復(fù)原,柱效很快降低,甚至完全失效。當(dāng)在緩沖液中加入有機(jī)溶劑例如甲醇或乙腈時(shí),鹽類的溶解度下降,會(huì)析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽會(huì)腐蝕色譜柱頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響,對(duì)于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì)破壞填料,反之,對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠,極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì)破壞陽(yáng)離子交換樹脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
2.2 樣品和固定相
如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中,在通過(guò)固定相會(huì)堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過(guò)柱子時(shí)會(huì)產(chǎn)生不可逆吸附,這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì)與固定相產(chǎn)生反應(yīng),尤其是對(duì)于氨基柱的影響較為嚴(yán)重,因?yàn)榘被着c酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性以及會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過(guò)硅氧硅鍵(Si-O-Si)連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R(R為CnH2n+1),硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團(tuán)脫落。
3 高效液相色譜柱的管理
3.1 色譜柱的管理
制定色譜柱管理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。每一根新購(gòu)進(jìn)的色譜柱必須造冊(cè)登記,內(nèi)容包括:生產(chǎn)公司、品名、型號(hào)、規(guī)格、購(gòu)進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內(nèi)保護(hù)溶液等。色譜柱分類存放,硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒,盒上貼上標(biāo)簽,注明類別。隨柱說(shuō)明書裝入密實(shí)袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標(biāo)簽,注明啟用日期。每根柱子每?jī)蓚€(gè)月保養(yǎng)一次,特別是對(duì)于一些使用頻率少的柱子,因?yàn)榉胖脮r(shí)間長(zhǎng),容易干柱,每一次做好保養(yǎng)記錄。對(duì)于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專門存放,如果現(xiàn)用的柱子的填料需要填補(bǔ),可以用存放的柱子的填料。在從事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門,對(duì)于使用時(shí)間較長(zhǎng)柱效降低的柱子,可把它用于檢測(cè)產(chǎn)品的中間體。
3.2 色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱使用一段時(shí)間后,常遇到柱子被污染,柱效會(huì)有一定程度的下降,采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù),可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。
樣品和流動(dòng)相的處理:溶解的樣品進(jìn)樣前用濾膜過(guò)濾,以除去不溶物。如果必要,需進(jìn)行樣品的預(yù)處理。流動(dòng)相中如有不純物質(zhì)將影響柱效,所以溶劑盡量使用色譜級(jí)別的,至少是分析純級(jí)別,流動(dòng)相使用前用微孔薄膜過(guò)濾。在流動(dòng)相的輸液管前安裝過(guò)濾器。過(guò)濾器定期用甲醇超聲清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡清洗。對(duì)于堵塞嚴(yán)重的過(guò)濾器,可在火焰上灼燒后再清洗。
保護(hù)柱(預(yù)柱)的使用:對(duì)于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護(hù)柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對(duì)于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護(hù)柱尤為重要。
常規(guī)處理:硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用完后用低流速長(zhǎng)時(shí)間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗;鍵合相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用蒸餾水沖洗,再用甲醇沖洗,然后用甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗后過(guò)夜。
對(duì)于已使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按以下方法進(jìn)行再生。再生處理包括活化(右→左)和凈化(左→右)兩種。硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序沖洗:三甲基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相硅膠柱:蒸餾水←→甲醇(沖洗過(guò)程中可加入少量二甲基甲酰胺)。離子交換樹脂柱:高濃度的NaCl溶液(1-2molL的NaCl溶液)可使大部分樹脂再生,油脂等少數(shù)與樹脂緊密結(jié)合的物質(zhì)可用低濃度堿溶液(如0.1molL的NaOH溶液)沖洗,酸性有機(jī)物吸附在固定相的用低pH緩沖液沖洗,堿性有機(jī)物用高pH緩沖液沖洗,然后再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸餾水沖洗。凝膠色譜柱:由于凝膠色譜柱是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量大小而分離物質(zhì),通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑(0.2%-1%NP-40或Lubrol)沖洗可除去大部分的結(jié)合物質(zhì),如果一些污染物仍然不能清除時(shí),用24%或30%乙腈沖洗過(guò)夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去親水蛋白,用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量胃蛋白酶,然后再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
已污染的色譜柱的處理:因保留強(qiáng)的物質(zhì)污染,流動(dòng)相或樣品中不溶物沉積于柱頭,可用下列方法洗滌:去除脂類可用四氫呋喃、乙腈或甲醇洗滌;去除蛋白質(zhì)可用乙腈、丙醇和1%三氯乙酸進(jìn)行梯度洗脫;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脫,同時(shí)反復(fù)注入100-200ml的四氫呋喃。
柱頭處理:對(duì)于柱頭堵塞污染嚴(yán)重的情況而且用溶劑沖洗無(wú)效的色譜柱,只有打開柱子去除柱頂?shù)奶盍现匮b:先拆下不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器,檢查柱床,常見凹陷或受污染的帶色填料,剔去不規(guī)則床層和帶色填料,使柱床顯白色并完全水平,再用甲醇作糊狀填料勻漿液,將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液,重復(fù)直到填料水平。
柱子的貯存:首先柱子必須清洗干凈后才能貯存,柱子不能貯存在水或水性溶劑中,否則會(huì)引起微生物的滋生。極性色譜柱可用適當(dāng)溶劑如二氯甲烷沖洗;鍵合相色譜柱用甲醇沖洗;陰離子交換色譜柱用0.002%洗必泰(雙氯苯雙胍己烷)的緩沖液沖洗,陽(yáng)離子交換色譜柱用0.005%硫柳汞緩沖液沖洗;凝膠色譜柱用。
【導(dǎo)讀】凝膠過(guò)濾色譜柱用于體積排阻層析 體積排阻，也叫凝膠過(guò)濾,根據(jù)物質(zhì)尺寸大小的不同分離。如果分子的尺寸大于樹脂的最大孔徑，這種分子就不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)部，它所經(jīng)過(guò)的有效體積最小，最先從洗脫液中流出。
凝膠過(guò)濾色譜柱用于體積排阻層析
體積排阻，也叫凝膠過(guò)濾,根據(jù)物質(zhì)尺寸大小的不同分離。如果分子的尺寸大于樹脂的最大孔徑，這種分子就不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)部，它所經(jīng)過(guò)的有效體積最小，最先從洗脫液中流出。而小分子能夠進(jìn)入樹脂的孔道中，經(jīng)過(guò)的有效體積比較大，從洗脫液中流出較晚，分子量越小，流出越晚。
體積排阻層析可以用于純化的第一步，按分子量大小將產(chǎn)品粗分；也可以用作純化的中間步驟來(lái)改換緩沖液或脫鹽，或用于純化的最后一步來(lái)去除雜質(zhì)，精制產(chǎn)品。
體積排阻層析樹脂有預(yù)先設(shè)定的排阻極限，排阻極限由樹脂本身的最大孔徑和孔徑分布范圍決定。MKF有機(jī)凝膠型大孔填料規(guī)格有：7-10μm超細(xì)顆粒，具有很高的分辨率；20μm，40μm中等顆粒，用于制備型的純化步驟；60-80μm較粗顆粒，用于經(jīng)濟(jì)型制備的純化步驟；100-150μm粗顆粒，用于產(chǎn)物的大規(guī)模捕獲。
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1．防止緩沖溶液和水溶液流動(dòng)相產(chǎn)生微生物，做到流動(dòng)相用多少配多少，或在水流動(dòng)相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細(xì)菌成長(zhǎng)（一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動(dòng)相中加20%的有機(jī)改性劑，也可抑制微生物生長(zhǎng)，有機(jī)改性劑還有助于流動(dòng)相脫氣。
2．盡可能將色譜柱貯存于100%有機(jī)溶劑（乙晴可以）中，避免在緩沖溶液中保存。
3．使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機(jī)溶劑流動(dòng)相沖洗色譜柱，后換成100%有機(jī)溶劑儲(chǔ)存。
4．避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18柱。
5．將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。
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